[发明专利]一种龙葵抗虫基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗虫基因技术领域，具体的说，涉及一种龙葵抗虫基因及其应用。

背景技术

虫害是造成农业减产的重要原因之一。据统计，各种作物因虫害而遭受的经济损失平均达20％-30％，每年大约损失数千亿美元。植物抗虫基因工程的诞生，为防治害虫提供了一条崭新的途径。由于该方法具有安全，有效，可降低投资和减少环境污染等诸多优点，因而自1987年首次报道抗虫转基因植物以来，植物抗虫基因工程的研究取得了迅猛发展。

目前广泛应用于植物抗虫基因工程的抗虫基因按来源可分为三类：一类是来源于微生物苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白基因；第二类是来自高等植物的蛋白酶抑制剂(PI)基因和凝集素基因；第三类为动物来源的蛋白酶抑制剂基因和动物毒素基因。此外，几丁质酶基因、核糖体失活蛋白基因、淀粉酶抑制剂基因、胆固醇氧化酶基因、豌豆脂肪氧化酶基因、多酚氧化酶基因、系统肽、Bt营养期杀虫蛋白基因、异戊烯基转移酶基因及一些非蛋白类杀虫剂的合成调控基因也可用于抗虫植物基因工程。

Bt毒蛋白是最先利用的基因，其发展已经有几十年的历史了，应用的比较成熟。与其它抗虫基因相比，在同等表达量下，Bt类基因产物的抗虫能力最强。人们将克隆出的Bt转入植物后，使植物的抗虫性得到了提高，已经有很多种的植物因为转入了Bt蛋白而提高了抗虫性，转Bt蛋白的植物也成功进入商品市场。但是由于Bt蛋白的毒性太强，对昆虫的选择压力太大，昆虫容易产生抗性，从而不被Bt杀死。由此，人们普遍把目光转向了一种新的抗虫基因-蛋白酶抑制剂。

天然的蛋白酶抑制剂(PI)是一类对蛋白水解酶有抑制活性的小分子蛋白质，普遍存在于植物，动物和微生物中。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合，抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶，抑制蛋白酶降解蛋白质的能力。几乎所有的蛋白酶抑制剂都会与其目的蛋白酶结合，形成一个稳定的，没有酶活性的蛋白酶-抑制剂复合物，从而导致蛋白酶的失活。

根据氨基酸序列的同源性，可以将目前发现的蛋白酶抑制剂划分为22个家族，包括：马铃薯蛋白酶抑制剂I家族(PIN I)、马铃薯蛋白酶抑制剂II(PIN II)家族、Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂家族、Bowman-Birk蛋白酶抑制剂家族、Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂家族、胶原酶抑制剂家族、羧肽酶抑制剂家族等等。而根据所抑制酶的活性基团，蛋白酶抑制剂则可划分为四大类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂。

蛋白酶抑制剂在医药领域和植物抗病抗虫领域都有重要的作用。大多数昆虫(如大部分鳞翅目、直翅目、双翅目、膜翅目以及某些鞘翅目)的消化酶以丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)为主，因此丝氨酸蛋白酶抑制剂可以有效抑制这类昆虫的生长和发育。PINII属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，主要对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制作用。PIN I和PIN II可以抗鳞翅目昆虫，其中PIN II蛋白酶抑制剂的抗虫性要优于PIN I，因而在抗虫基因工程中有广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的蛋白酶抑制剂龙葵抗虫基因。

本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组质粒。

本发明的另一个目的是提供上述重组质粒转化的重组微生物。

本发明的进一步目的是提供上述龙葵抗虫基因在增强植物抗虫能力中的应用。

本发明克隆的龙葵抗虫基因，属于PIN II基因家族，是一种在龙葵韧皮部特异表达的基因，其mRNA主要在伴胞和未成熟的筛分子中转录，其蛋白质主要定位于筛分子周壁细胞质和筛分子腔内，以及筛域孔部位。其编码的蛋白是一种可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的丝氨酸型蛋白酶抑制剂。该基因构建的植物表达载体，在花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子的驱动下超量表达，可获得具有抗虫能力的转基因植株。

本发明为了得到理想的外源蛋白表达效果，在龙葵蛋白酶抑制剂Ha基因(SaPIN2a)基础上克隆了包含其5’端非翻译区(5’UTR)的全长龙葵蛋白酶抑制剂A的cDNA序列，得到的基因命名为NPIA，该基因长496 bp(见SEQ ID NO：1)。其编码的氨基酸序列见SEQ IDNO：2。

本发明中的NPIA基因可与植物表达载体质粒pBI121重组，构建获得龙葵蛋白酶抑制剂A基因的植物表达载体pF-121，NPIA基因由CaMV 35S启动子控制表达。