[发明专利]一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于水产学科生物技术领域，具体是涉及一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒。

背景技术

螺原体类(spiroplasma)微生物能在淡水甲壳动物及其他经济水生动物(克氏原螯虾和南美白对虾等)中传播，对水产养殖构成了极大的威胁。目前水生动物螺原体病原的检测可以利用光镜，电镜技术，微生物学，和分子生物学方法，这些技术已运用于我们实验室虾蟹类螺原体病原的常规检测，但这些检测实验操作复杂，需要特定的专业技能和仪器设备，很难在生产实际中推广运用。以血清学反应原理为基础的酶联免疫吸附(Enzyme-Linked immunosorbent assay，ELISA)检测方法在不需要特殊仪器的情况下，可直接通过肉眼观察颜色反应变化来鉴别检测结果，具有简洁方便，特异性强，灵敏度高等优点，所以快速有效的检测方法和试剂盒急待开发。特别是其多抗制备条件需要进行不断摸索，以便获得高效价的抗体，为试剂盒研制奠定基础。

发明内容：

本发明的目的是提供一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒，包括包被液、洗涤液、小牛血清、一抗血清、酶结合物工作液(二抗)、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照和酶标板条；所说的显色液分为四甲基联苯胺(TMB)、柠檬酸-磷酸盐缓冲液和双氧水；所说的阳性对照是含水生动物螺原体的样本，阴性对照是不含螺原体的样本，一抗血清为水生动物螺原体的多克隆抗体，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG多克隆抗体。

本试剂盒中所用的包被液、洗涤液、显色液、终止液、小牛血清以及酶结合物工作液是酶联免疫中常规试剂。具体地，所说的包被液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸缓冲液；洗涤液为含0.05％吐温-20、pH7.4的磷酸缓冲液；显色液成份有柠檬酸-磷酸盐缓冲液，四甲基联苯胺(TMB)固体，30％过氧化氢液体；终止液为2mol/L硫酸溶液。

所说的酶标板条优选12孔。

上述所说的阳性对照中的水生动物螺原体，优选蟹螺原体Spiroplasma.CRAB，龙虾螺原体Spiroplasma.CRAYFISH和南美白对虾螺原体Spiroplasma.SHRIMP。

其中，水生动物螺原体的多克隆抗体可通过常规的动物免疫方法(免疫抗原采用破碎或全菌的，灭活或不灭活，免疫方式采用腹部皮下注射，耳静脉注射，注射加佐剂或不加佐剂注射，3次和4次免疫)获得，但本发明推荐用以下方法制备：采用经甲醛灭活后的螺原体全菌作为免疫抗原，在健康新西兰大耳兔腹部多点与耳静脉相结合进行4次人工免疫，前两次注射抗原加等体积佐剂，经效价检测后，通过心脏抽血，分离获得高效价螺原体多克隆抗体。

本发明的检测原理为：在检测中，将对照样本和待检样本分别包被微孔板(聚苯乙烯微量滴定板)，孵育后，经洗涤加入制备好的水生动物螺原体多克隆抗体(一抗)，该抗体与结合在微孔板上的抗原发生特异性结合；洗涤后除去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG多抗(二抗)；孵育后再经洗涤除去未结合的酶结合物，显色后终止。阳性对照显示出黄色，阴性对照则无显色，根据待测样本的显色反应与对照进行比对，即可得到检测结果。

本发明的检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒，主要采用间接ELISA方法，检测水生动物血液和肌肉样品中的螺原体，该试剂盒使用方便，快速，经济，敏感性高，特异性强，重复性好，便于推广应用，能有效的检出样本中的螺原体。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所说的螺原体是依照现有技术从患颤抖病的中华绒螯蟹，患系统性疾病的龙虾和南美白对虾体内分别分离培养出：蟹螺原体Spiroplasma.CRAB，龙虾螺原体Spiroplasma.CRAYFISH和南美白对虾螺原体Spiroplasma.SHRIMP；申请人保存的上述菌株20年内可以向公众提供。

实施例1：检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒

(1)抗原的制备