[发明专利]重组鸡痘病毒疫苗rFPV－1218AIH5/N1及其构建方法、用途

权利要求书

1、重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1，其特征在于该疫苗为含同时表达H5亚型AIV HA基因和NA基因的重组鸡痘病毒疫苗，保藏号CGMCCNO：1915。

2、如权利要求1所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)获得含H5亚型AIV HA基因整个阅读框架的基因片段；

(2)获得含H5亚型AIV NA基因整个阅读框架的基因片段；

(3)将上述基因片段置于各自的合适启动子下游，插入到含FPV复制非必需片段FPV12-18和报告基因LacZ的鸡痘病毒表达载体p12-18中构建成转移载体p1218AIH5/N1；

(4)用转移载体p1218AIH5/N1转染已感染wt-FPV的鸡胚成纤维细胞CEF，通过同源重组获得共表达H5亚型AIV HA和NA基因的rFPV；

(5)增殖和收获共表达H5亚型AIV HA和NA基因的rFPV，即重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1。

3、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的构建方法，其特征在于步骤(1)中，H5亚型AIV HA基因可以通过以下方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，通过以下引物

PH5A1  5’-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTTTTCTT-3’

PH5A2  5’-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3’

先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H5亚型AIV HA基因整个阅读框架。

4、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的构建方法，其特征在于步骤(2)中，H5亚型AIVNA基因可以通过以下方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，通过以下引物

PNA1  5’-CCCGGGGCCACCATGAATCCAAATCAGAAGATAA-3’

PNA2  5’-TCTAGAAAGCTTAAAAAAATTACTTGTCAATGGTGAATGG-3’

RT-PCR扩增出H5亚型AIVNA基因整个阅读框架。

5、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的构建方法，其特征在于步骤(3)中，启动子可以是任何能够在重组鸡痘病毒感染细胞中指导基因转录的FPV启动子、痘苗病毒启动子或人工合成启动子。

6、根据权利要求2或5所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的构建方法，其特征在于步骤(3)中，启动子和步骤(1)、(2)获得基因通过酶切加接的方法或用PCR设计引物加接的方法连接在一起，按常规方法将其插入到含FPV复制非必须片段FPV12-18和报告基因LacZ的FPV插入载体中，构建成转移载体p1218AIH5/N1。

7、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的构建方法，其特征在于步骤(4)中，用GeneJammer^TM转染试剂将转移载体分别与wt-FPV共转染鸡胚成纤维细胞CEF，将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有X-gal的营养琼脂覆盖，蓝斑筛选纯化得重组病毒rFPV-1218AIH5/N1。

8、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的构建方法，其特征在于在鸡胚成纤维细胞CEF单层上增殖，使病毒在鸡胚成纤维细胞CEF中扩增。

9、重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/N1的用途，用于防治H5亚型禽流感。