[发明专利]肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程、生物技术及医药领域，特别是构建一种能通过与肿瘤细胞表面相关抗原识别与结合，特异性感染并且杀伤肿瘤细胞的重组新城疫病毒及其构建方法。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一种引起家禽呼吸道感染等症状的负链RNA病毒。由于NDV对人类无致病原性，而且具有在肿瘤细胞选择性复制的特点，因而近年来用于肿瘤的治疗。

NDV为不分节、负链RNA副粘病毒，直径为100～400nm，近似球形，核衣壳被一个来源于细胞质膜的双层脂质膜包被。RNA基因组全长约15186个核苷酸，包含6个基因，分别编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrix protein，M)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)和RNA依赖的RNA聚合酶(large polymerase，L)。其中HN和F蛋白表达在病毒的包膜上，HN蛋白通过和宿主细胞表面含唾液酸的糖蛋白受体结合，继而HN和F蛋白相互作用，激活F蛋白的融膜作用，最终NDV膜和靶细胞膜相互融合，从而病毒进入胞浆复制。

NDV在肿瘤细胞选择性复制的机制和肿瘤细胞的干扰素信号通路缺陷有关。根据在人肿瘤细胞内复制的特点，NDV分为非溶瘤株(如：NDV-Ulster和NDV-LaSoda等)和溶瘤株(如：NDV-Italien和NDV-PV701等)。非溶瘤株NDV一般在肿瘤细胞只能进行单周期复制，新生病毒颗粒没有再感染能力；而溶瘤株则能进行多次循环复制，新生病毒可继续感染邻近细胞，因而具有较强的杀伤力。

目前NDV治疗肿瘤的研究集中在两个方面：1)由于NDV具有诱导T细胞共刺激活性、诱导细胞因子和局部趋化因子，增强肿瘤特异性抗原表达，从而刺激机体产生特异性抗肿瘤的作用，因此临床上用NDV感染患者自体肿瘤细胞制成瘤苗(NDV-modified autologoustumor vaccine，ATV-NDV)对患者进行术后主动免疫治疗。由Schirrmacher实验室在德国进行的ATV-NDV治疗头颈鳞癌已完成II期临床，显示了良好的疗效。2)NDV在肿瘤病毒治疗和基因治疗方面的应用。基于溶瘤株NDV具有直接杀伤癌细胞和诱导癌细胞凋亡的特点，减毒NDV溶瘤株如，NDV-PV701和MTH-68/H被用来直接静脉注入患者体内进行肿瘤的病毒治疗。

由于RNA病毒其复制过程中不形成DNA中间体，对RNA病毒基因组直接用DNA的分子生物学技术操作存在困难。上世纪九十年代末反向遗传学技术的出现为这一领域开辟了新途径。该技术是将病毒RNA逆转录成cDNA，由含病毒基因组cDNA的质粒获取病毒的方法。

尽管NDV选择性在人肿瘤细胞复制，但由于NDV-HN的受体是含唾液酸的糖蛋白，一种广泛存在于细胞膜上的分子，因此NDV具有广谱的细胞亲嗜性。这个不利的因素造成当静脉注射NDV时，NDV和正常细胞吸附，无疑减少了NDV最终结合靶肿瘤细胞的剂量。另一方面，我们发现NDV和小鼠或人红细胞结合，导致严重的凝血和溶血。

发明内容

为了克服目前NDV对肿瘤细胞缺乏靶向性结合的不足，本发明通过反向遗传操作的方法，提供一种肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法，通过定点突变技术以消除NDV上HN的天然唾液酸识别位点，同时将具有肿瘤靶向性的抗肿瘤抗原scFv融合到HN的羧基端，以获得肿瘤靶向性的重组NDV。

本发明所采用的技术方案是：具有肿瘤靶向性的重组新城疫病毒，所述的重组新城疫病毒Italien株的病毒基因组，其cDNA是序列表<400>1的序列。