[发明专利]肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法

权利要求书

1.具有肿瘤靶向性的重组新城疫病毒，其特征在于：所述的重组新城疫病毒Italien株的病毒基因组，其cDNA是序列表<400>1的序列。

2.如权利要求1所述的肿瘤靶向性的重组新城疫病毒构建方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)分段RT-PCR扩增新城疫病毒Italien株的病毒基因组以获得6个cDNA亚片段(NPP、PF、FHN、HNL、La、Lb)，然后连接为3个大片段(NPP、PF+FHN、HNL+La+Lb)，最后连入pBR322载体，得到包含新城疫病毒Italien株全长基因组cDNA的质粒pBR-rNDV；辅助表达质粒的构建：用相应的引物，PCR分别扩增NP和P基因，酶切后克隆到真核表达载体pCIneo中，获得质粒pCI-NP和pCI-P，L基因则通过用Sac II/Aal I双酶切含L基因的亚基因cDNA片段，然后克隆至pCIneo中，获得质粒pCI-L；体外复活病毒：将pBR-rNDV、pCI-NP、pCI-P和pCI-L共同转染能够稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞，获得复活的重组病毒rNDV；(2)构建HN基因与肝癌HAb18 scFv融合表达质粒pcDNA-HNmu/scFv质粒：在病毒基因组中HN的开放读码框3’端通过G4S linker连接能够特异性识别肿瘤抗原的靶向性抗体scFv序列，定点突变HN基因三个关键氨基酸I175E、R516S和P93G；(3)构建包括F末端、F和HN之间的连接序列、EGFP序列以及HN前端序列的质粒pUC18/F-EGFP-HN；(4)用HNmu-scFv和F-EGFP-HN片段分别通过酶切替换pBR-rNDV中的HN基因片段和F-HN基因之间相对应的片段。

3.如权利要求1所述的肿瘤靶向性的重组新城疫病毒，其特征在于：治疗基因可以插入质粒pBR-rNDV中的NP基因开放读码框前、NP和P之间、P和M之间、M和F之间、F和HN之间、HN和L之间以及L之后。