[发明专利]一种低温脂肪酶及其基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及从海洋假单胞菌(Pseudomonas sp)中分离纯化的一种低温脂肪酶及其编码的基因序列，低温脂肪酶工程菌的构建，以及利用该工程菌制备低温脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)又称甘油酯水解酶，是指分解高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酯酯键的酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物中。

脂肪酶作为一种重要的工业酶，可应用于油脂水解、食品风味和香味的改进、医疗医药、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性、添加于洗涤剂和化妆品中等。特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。

微生物脂肪酶种类多且具有比动物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围和更多对底物的专一性类型，又便于工业生产以获取高纯度制剂，同时微生物脂肪酶在酶的理论研究和实际应用中也发挥着重要作用。

脂肪酶已从多种不同的微生物中得到分离研究，如青霉、白地霉、根霉、假丝酵母等。其中多数脂肪酶的最适作用温度在50℃左右，在低温时的酶活力很低。因而具有优良低温活性的低温脂肪酶成为酶学研究新的热点。低温脂肪酶具有下列4个特征：(1)在较低的温度下可以得到较多的脂肪酶。(Feller G，et al，Microbioz Biotechnol，1994(41)：477-479)(杨秀霞等，生命的化学，2003，23(3)：204-206)(2)低温脂肪酶的最适作用温度较低。(Arpigny JL，et al，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，1997(3)：29-35)(3)低温脂肪酶的比活力高，热稳定性差。一般说来，酶的比活力是和热稳定性呈负相关。(4)低温脂肪酶的活化能低。(Arpigny JL，et al，Biochem Biophys Acta，1993(1171)：331-333)。应用基因工程技术克隆表达低温脂肪酶基因为新的酶产品的开发利用提供了广阔的前景。

关于脂肪酶基因已有一些文献报道和专利。如Raja等报道的热稳定脂肪酶(美国US2006/0062789)；Jeon J H等报道的来自深海的低温脂肪酶(韩国KR2006103045-A)；Mlasnikov A等报道的来自链霉素的脂肪酶(欧洲专利WO2006008653-A2)；Rey等报道的脂肪酶(美国US 2002/6423898)；Yuji等报道的脂肪酶(日本JP 1990/2174680)。

近年来脂肪酶的应用范围不断拓宽，已成为目前国际上最为重要的工业酶之一。不仅应用于人们的日常生活中，如洗衣粉、污水处理，还应用于精细化工、生物柴油、医药工业、食品工业等行业中。来源于不同脂肪酶的底物专一性、最适催化条件和稳定性都有差异。其中低温脂肪酶以其高度的低温稳定性而具有更广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温脂肪酶及其编码基因，其工程菌的构建方法和利用该工程菌生产低温脂肪酶的方法与应用。该低温脂肪酶在低温下具有较好的活性和稳定性，可以应用在洗涤剂工业、食品工业、生物制药、环境生物技术等。

本发明从海洋假单胞菌(Pseudomonas sp)分离的低温脂肪酶，其基因序列是由1131bp组成的DNA片段，编码一个由376个氨基酸组成的蛋白质。该酶的分子量为37000KDa，反应温度为0-30℃，最适作用温度为25℃，在0℃仍可保持37％的相对酶活，反应pH为6-9，最适pH为8.0。

本发明提供一种编码低温脂肪酶的基因，该基因具有下列核苷酸序列：

①序列表中SEQ No.1所示的核苷酸序列。

②不同于SEQ No.1，但编码的氨基酸序列与SEQ No.1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。

③与序列表中SEQ No.1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

④在中度严谨条件下能与序列表SEQ No.1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

本发明提供一种低温脂肪酶，该酶具有下列氨基酸序列：

①权利要求2所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

②SEQ No.2所示的氨基酸序列。

③或者是将SEQ No.2的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ No.2的氨基酸序列相同活性的由SEQ No.2衍生的蛋白质。

本发明中生产低温脂肪酶的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一的原核细胞或真核细胞：