[发明专利]一种强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用

说明书

技术领域

本发明涉液相色谱技术，具体的说是一种易操作、维护方便、无需增加额外硬件装置，并可实现了纳升级毛细管柱高效液相色谱与串联质谱联强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用。

背景技术

翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组中研究的热点课题。蛋白质磷酸化是最常见，最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节者生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化还是目前所知道的信号转导的主要传递方式。

蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记，Edman降解以及薄层层析等方法。这些方法操作繁琐，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，而且存在潜在的放射性危险。质谱技术已经发展成为鉴定磷酸化蛋白的重要工具之一。但是质谱在鉴定磷酸化蛋白现在仍然面临着巨大的挑战，其具体体现在：第一，磷酸化蛋白在细胞内中属于低丰度蛋白；第二，磷酸化肽段的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的大量的非磷酸化肽段的质谱信号通常会淹没磷酸化肽的离子信号。因此，复杂蛋白酶解产物中磷酸化肽段的分离，纯化和富集是质谱成功鉴定磷酸化最为重要的一步。磷酸化蛋白组的研究中，通常运用两种不同的富集策略，富集磷酸化蛋白和富集磷酸化肽段。磷酸化蛋白的富集主要是通过磷酸化蛋白质的抗体和化学方法进行修饰改变磷酸基团的化学性质，然后特异性的分离纯化。磷酸肽段的富集使用最多的是固定化金属亲和色谱(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC(Fe³⁺，Ga³⁺))。近来TiO₂和ZrO₂微柱，Al(OH)₃，Fe₃O₄/TiO₂壳孔纳米颗粒等也被用来特异纯化和富集磷酸肽。另外一种常用的方法是化学标记，通过化学反应特异地将磷酸基团修饰成亲和位点而达到纯化和富集磷酸肽的目的。

然而，磷酸化蛋白质及其酶解物样品自动化进样、分离分析仍然是磷酸化蛋白质组研究中的巨大挑战.目前大规模磷酸肽样品的自动化分析主要利用大内径但较短的毛细管柱作为预柱，采用大流速进样，然后再进行分离分析。Licklider等人(“Automation of nanoscale microcapillary liquid chromatography-tandem massspectromentry with a vented column”，《Analytical chemistry》，P3076-3083，2002年)发明了一种带排泄口的自动化的预柱装置，能够快速高效的自动化进样进行分离分析。而在之前，所有的自动化的操作都是采用阀切换的模式进行，整个装置构建很复杂，维护不便，且样品损失量相当大。但Licklider等人的装置也存在预柱更换不方便和易堵塞的缺点。有鉴于此，非专利文献2中Yi等人(“Amicrocapillary trap cartridge-microcapillary high-performance liquid chromatographyelectrospray ionization emitter device capable of peptide tandem mass spectrometry atthe attomole level on an ion trap mass spectrometer with automated routine operation”，《Rapid Communication.Mass Spectrometry.》，P2093-2098，2003年)进一步发展了这种自动化系统，使得预柱固定相易于更换，便于维护，且进一步减小了死体积，降低了样品的损失。但是，在这些系统中，由于预柱与分离柱都是采用的反相C18作为固定相，它们之间的死体积对分离的影响较大，所以仍然存在分离时间延迟、峰展宽和分离窗口变窄等缺陷。而且由于磷酸肽亲水性强，使用C18预柱有可能引起较大的样品损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种易操作、维护方便、无需增加额外硬件装置，并可实现了纳升级毛细管柱高效液相色谱与串联质谱联强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用。