[发明专利]对映体选择性酶还原羟基酮化合物的方法

说明书

本发明涉及对映体选择性酶还原通式I之羟基酮的方法：

所述通式I中，R₁＝C₁-C₆烷基，R₂＝-Cl，-CN，-OH，-H或者C₁-C₆烷基，以得 到通式II的手性二醇：

其中R₁与R₂与通式I中的含义相同，在辅因子的条件下，用氧化还原酶还 原羟基酮。

通式II的手性二醇是药品生产，特别是HMG-CoA-还原酶抑制剂生产过程 中的重要中间化合物。所述手性二醇是例如叔-丁基(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸 酯、叔-丁基(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸酯或者叔-丁基(5S，3R)-3，5，6-三羟基己 酸酯。

这种类型的二醇特别是通过对映体选择性还原相应的通式I羟基酮，例如叔 -丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯、叔-丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯 或者叔-丁基(5S)-5，6-二羟基-3-氧代己酸酯而形成。这种化学催化还原反应的缺 点是，一方面，苛刻的反应条件会形成副产物，另一方面，形成不需要的对映 体或者非对映异构体过量，并且该技术的成本非常高。

由于上述原因，人们一直在探索生物催化方法，以便用所述方法对映体选择 性还原所述的羟基酮。生物催化方法通常在温和的条件下完成，期待着在没有 进一步的副产物形成的情况下，还原已经很不稳定的5-羟基-3-氧代己酸酯衍生 物。但是，迄今一直没有找到适宜的生物催化剂，用所述催化剂能够有效地酶 促还原所述的5-羟基-3-氧代己酸酯并且是用分离的酶。

美国专利6001615和国际专利申请WO01/85975 A1例如描述了用来自白僵 菌(Beauvaria)、Pichia、念珠菌、克鲁维酵母菌、Torulaspora的不同酵母还原叔- 丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯或者者叔-丁基(5S)-5，6-二羟基-3-氧代己酸 酯的方法。但是所述转化使用野生菌株的整个细胞，并且在远低于5％的很小浓 度下完成。这是由于迄今为止，尚未鉴定出与转化有关的酶以及其DNA序列。

此外，在EP 0569 998 B1中描述了微生物转化结构相似的化合物。其中从 Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305中纯化了NADH依赖性酶，并以与葡萄 糖脱氢酶一起分离的形式，用于辅酶再生。在所述方法中，所述底物的浓度为 1％，NADH的“总转化数”仅为10。因此，尚未描述适于工业应用的方法。

在美国专利6645746 B1中公开了Candida magnoliae的一种氨基酸序列，用 所述氨基酸序列可以有助于NADPH还原叔-丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯 至叔-丁基(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸酯。在该文献的说明书中，优选将所述酶 与共表达的巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶一起使用，葡萄糖脱氢酶有助于辅因 子NADPH的再生，且葡萄糖作为共底物而产生。

本发明面对该任务，提供了一种方法，该方法可以经济地以高产率和高对映 体纯度，且没有副产物而产生通式II的纯对映体二醇。

根据本发明，由前述类型的方法而完成了所述任务，即在NADH或者 NADPH作为辅因子的条件下，通过氧化还原酶还原而实现，其特征在于，其中，

a)羟基酮在反应混合物中的浓度≥50g/l，

b)通过通式R_XR_YCHOH的二级醇氧化持续再生所得的氧化辅因子NAD或 者NADP，其中R_XR_Y彼此独立是氢、支链或者无支链C₁-C₈烷基，且C_总数≥3， 和

c)羟基酮的还原和二级醇的氧化由相同的氧化还原酶催化。

因此，所述方法优选实施方案的特征在于，所述氧化还原酶

a)含有氨基酸序列，其中至少50％的氨基酸与氨基酸序列SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11或者SEQ ID NO：14的那些相同，