[发明专利]病毒诊断方法及其使用的池

说明书

技术领域

本发明涉及一种适于病毒诊断方法中使用的单个扁平底部型的池(single flat-based well)。更具体地说，该池具有与弯曲的底部相对的平面或扁平的底部。本发明还涉及采用这种单个池的病毒诊断方法。在该方法的一个实施方案中，采用了添加有激素和酶的专门研制的组织培养基。

发明背景

用于鉴别病毒的常规诊断过程包括下述步骤：将所选的对某种病毒易感的特定细胞系接种于容器，然后将假定含有病毒的生物样品接种于该细胞培养物。此类生物样品除了包括其它物质外，还包括唾液、尿、排泄物、脑脊液(CSF)、呼吸液和诸如来自嘴、鼻腔、咽喉、皮肤和生殖器的化验样本。随后对接种的细胞培养物进行培养并考察所述细胞经由病毒诱发的细胞病变效应。由于某些病毒仅生长于某些细胞，因此可以病毒诱发细胞病变效应(CPE)或未诱发细胞病变效应的细胞类型为基础对病毒进行鉴别。

对于此过程具有大量备选的实验方案，其包括下述步骤：使已接种有病毒制品的细胞经受胰蛋白酶作用(trypsonisation)以便除去该细胞，随后使用对源自病毒的多肽具有特异性的单克隆抗体来检测病毒，所述源自病毒的多肽使用报道分子，比如荧光素(FITC)分子进行标记。另外的备选方案包括在培养管内的盖玻片以便促进细胞的恢复。

常规的(或传统的鼓法)方法使用了接种有适当细胞系的螺旋盖管(screw cap tubes)。在细胞达到约80％的融合率后，将该管接种适当的样本并监控CPE长达三周。第一周须每天监控CPE。第二周和第三周必须减少监控频率。通常，需要盲传来促进病毒的恢复。

由于需要每天对管进行监控，因此常规管法的一个不利之处在于费时费力。通常，为了避免主观性，两名人员通过光学显微镜对相同管的CPE进行检查。此外，并不是所有病毒均能引起可见的CPE，而且并不是所有的病毒都能通过该方法来检测。而且，在常规的管法中监控到的CPE信息高度依赖于细胞系的易感性以及病毒产生可见CPE的能力。样本的毒性还可能不利地产生类似于病毒CPE的变化，从而得出错误的结果。此外，某些病毒只有在很长的时间周期后才产生CPE(例如：细胞巨化病毒(CMV))。由于通过常规管法获得的结果主要是基于CPE检测并且不能按惯例通过任何其他的方法进行确证，因此可能出现不准确的诊断。常规管法的另一个局限性在于每个样本很难使用2个或3个以上的管，这可归因于其导致的管堆积。例如，仅在第一周，40个样本每天就会产生500个管。

快速培养法(shell vial method)是目前本领域技术人员用于病毒恢复的最先进的方法。该方法使用具有半透明盖子的、直径为16mm的5ml塑料瓶(快速培养瓶)。适当的处理之后，将圆形的(13mm)盖玻片插入该瓶。将易感的细胞系接种于瓶中，所述细胞系在盖玻片上单层生长。当细胞单层达到约80-90％的融合率时，弃去培养基并将所述单层和瓶接种上患者的样本。随后，监控培养瓶的CPE，之后除去盖玻片。然后将盖玻片固定于显微镜的载玻片并使用单克隆抗体染色。

快速培养法的优势在于接种后可以通过对瓶进行离心来促进病毒的恢复，快速培养法可将获得结果所需的时间长度缩短至2-3天。此外，使用快速培养法无需等待可见的CPE。可以在第二或第三天除去盖玻片并使用适当的单克隆抗体进行染色且使用抗体抗原染色来确证结果。

但是，快速培养法也有一些局限性。由于盖玻片需要下述的特殊处理因此快速培养法是耗时的：比如使用清洁剂和丙酮多次洗涤后用蒸馏水洗涤并灭菌。还必须人工将盖玻片插入瓶中。此外，需要进行荧光免疫染色时，该过程甚至变得更复杂和耗时。而且必须弃去快速培养瓶中的培养基并使用特殊的镊子人工除去盖玻片、空气干燥并固定于显微镜的载玻片(使用真空油脂)。由于操作的疏忽，或者无意地翻转并将颠倒的单层固定于显微镜的载玻片有可能使盖玻片破裂，因此盖玻片的去除是令人厌烦的。如果接种的细胞也生长在盖玻片底部上，由此造成盖玻片固定于所述瓶并使得盖玻片难以去除的话，那么可能会引起另一个不利因素(complication)。事实上，与常规管法一样，使用快速培养法不可能每个样本使用2个或3个以上的管，这可归因于管堆积(即，每周40个样本每天会产生500个快速培养瓶)。此外，为了覆盖13mm的圆形盖玻片，荧光免疫染色需要大量的单克隆抗体。