[发明专利]合成培养基中重组蛋白的生产

说明书

发明领域

本发明涉及通过合成培养基中的真核细胞生产重组蛋白。

发明背景

真核细胞系统目前用于大规模工业生产重组蛋白。HEK-293和CHO细胞和来源于其的克隆是最常使用的细胞系，且以悬浮形式或贴壁形式进行培养。为满足调控需要，所述生产系统现在必须要避免任何动物来源的化合物。已发展了能够培养HEK-293和CHO的无血清培养基。然而仍然以增殖因子的形式加入蛋白。有利地使用完全合成的培养基，所述培养基的组分已完全确定，即所有组分都是已知的且其中没有一种组分来源于动物。

已开发了有效地在合成培养基例如FreeStyle(InVitrogen)中有效地转染HEK-293细胞的特异性转染剂例如293-Fectin。然而，所述试剂只对针对其发展的培养基有效。

已大量地使用具有广谱性的转染剂，即对于聚乙烯亚胺的PEI。

本发明者现已发现PEI的衍生物作为用于通过任何合成培养基中的真核细胞生产重组蛋白的转染剂特别有效。使用其他聚亚烷基亚胺衍生物特别是聚丙烯亚胺衍生物也已获得相似的结果。

发明内容

因此本发明的目的在于提供用于生产重组蛋白的方法，该方法包括使用这些衍生物。

本发明的方法包括用包含基于多羟基化聚亚烷基亚胺衍生物的合成转染剂的组合物转染真核细胞。

本发明的方法包括基于高度亲水的聚亚烷基亚胺衍生物的转染的组合物。

所述聚亚烷基亚胺衍生物是分支的或线性的。所述聚亚烷基亚胺基团通过例如胺、酯或酰胺连接体连接至任何羟基化衍生物。

优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(缩写为PEI)或聚丙烯亚胺(缩写为PPI)。

有利地，多羟基化结构包含碳水化合物类例如单糖、二糖或寡糖。

所述碳水化合物结构更特别地包含糖例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖或岩藻糖残基。

所述碳水化合物结构还可相应于葡萄糖醛酸酯或酰胺寡聚物。

多羟基化结构可包含羟基化烷基基序例如乙氧基。

优选的转染组合物还包含一种或几种中性聚合物。

聚亚烷基亚胺的分子量(MW)优选地是大约1至1000kDa。

接枝至聚亚烷基亚胺的糖苷链包含1至20个osidic单位。

在优选的转染组合物中，聚亚烷基亚胺的氮残基的羟基化程度超过0.1％。对于例如乙氧基或丙氧基修饰的聚合物，羟基化程度可达到80％或更多。

本发明的方法特别适合用于非贴壁或贴壁细胞的有效和瞬时转染，将所述细胞生长在经改进用于重组蛋白生产的合成培养基中。

将在下面通过包含做为转染剂：糖基化PEI的转染组合物的用途给出和举例说明本发明的其他特征和有利方面。

该试剂在下文中用“TA”表示。

在所述的实例中，将参考图1至5，所述图各表示，

-图1，悬浮在合成培养基中的HEK-293细胞的转染，

-图2，悬浮在各种合成培养基中的CHO细胞的转染，和

-图3至5，悬浮的CHO细胞中的VEGF生产。

糖基化线性PEI缀合物的合成。

如之前由Erbacher P.等人，1999；1：210-222 Transfection andphysical properties of various saccharides，poly(ethyleneglycol)，and antibody derivatized polyethylenimines(PEI)所描述，在氰基硼氢化钠存在的情况下通过还原胺化法糖基化PEI。向在0.9ml，pH8.2的0.2M的硼酸盐缓冲剂中的线性PEI(100μmol的单体，jetPEI^TM，Polyplus-Transfection SAS)中加入S Gene Med.线性四葡萄糖(Glcα4-Glcα4-Glcα6-Glc，Sigma)，或线性四半乳糖(Galα3-Galβ4-Galα6-Gal，Dextra Laboratories Ltd)或乳糖(Glcα4-Gal，Sigma)(5μmol)和氰基硼氢化钠(25μmol，Aldrich)，然后在持续搅拌下在室温下放置96小时。在0.15M NaCl中的葡聚糖凝胶G25细柱(12.5×450mm，Fluka)上除去低分子量化合物。通过使用间苯二酚/硫酸微量法确定每PEl分子不同糖基结构的接枝程度(表示为每氮糖基基序的百分比)，该接枝程度为3-5％。