[发明专利]一种β－淀粉酶及其编码基因与生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶基因工程和酶工程领域中一种β-淀粉酶及其编码基因与生产方法，特别涉及一种微生物β-淀粉酶及其编码基因与生产方法。

背景技术

β-淀粉酶能够从淀粉的非还原末端水解相隔的α-1，4-葡萄糖苷键，产生β旋光性的麦芽糖，最早发现于高等植物中，在大麦、小麦、甘薯和大豆中含量较丰富。长期以来植物来源的大麦β-淀粉酶一直被用于多个领域。例如，在啤酒发酵业中代替大麦芽用于啤酒的生产，在食品业中添加β-淀粉酶水解淀粉制造麦芽糖浆和饴糖等。自1974年Higashihara首次确定Bacillus megaterium胞外淀粉酶是β-淀粉酶以来，相继发现了多种能够产生该酶的微生物，这些菌株大多属于芽孢杆菌属，如Bacillus cereus、Bacilluspolymyxa、Bacillus circulans，还有Clostridium thermosulfurogenes等。与植物β-淀粉酶相比，微生物来源的β-淀粉酶有较高的热稳定性，且具有大规模工业化生产的优点，而耐热β-淀粉酶在食品及饮料工业中有很大的应用价值。高温不仅可以增加淀粉的可溶性，而且可以防止杂菌的生长，这对于降低成本是十分有利的。因此，选育新的耐热微生物β-淀粉酶的研究工作在国内外受到广泛重视，这对于进一步促进淀粉糖工业和酿酒工业的发展有很大帮助。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种新来源的微生物β-淀粉酶及其编码基因。

一种β-淀粉酶，来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)WS06，它是与SEQ ID №：2的氨基酸序列具有至少85％的同源性，优选为具有至少90％的同源性，且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；较优选为序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；最优选为序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)WS06，已于2005年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1534。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)WS06 CGMCC №1534自仔猪结肠中分离得到。其菌落粗糙，不透明、不闪光，为污白色；细胞为椭圆至杆状，有芽孢，革兰氏阳性菌；生长pH值范围是6.0-8.0，最适7.0；温度范围20-50℃，最适35℃；兼性厌氧，水解淀粉。

序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列是由545个氨基酸残基组成的蛋白质。

一种β-淀粉酶的编码基因，它是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列，其中，优选为与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的SEQ ID №：1的DNA序列由1638个碱基组成，该基因的开放阅读框架(ORF)为自5’端第1到第1638位碱基。

含有β-淀粉酶的编码基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围。

所述细胞系可为芽孢杆菌(Bacillus sp.)WS06 CGMCC №1534或含有上述β-淀粉酶的编码基因的工程菌。

所述工程菌的出发菌株可为大肠杆菌或芽孢杆菌，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌K-12的EK系统成员，如DH5α、HB101、BL21和JM109，最优选为大肠杆菌DH5α；所述芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌的BS系统成员，如BD170、MI112和ISW1214。

可将上述β-淀粉酶的编码基因导入包括适用于EK系统的pET21a、pBR322、pBv220、pUC18和pUC19，以及适用于BS系统的pUB110和pHY300PLK等载体内，得到β-淀粉酶的编码基因的表达载体，如将上述β-淀粉酶的编码基因导入pET21a得到的表达载体pAML5(物理图谱如图3所示)。

扩增本发明的β-淀粉酶编码基因的任一片段的引物属于本发明的保护范围。

本发明的β-淀粉酶基因可用作从其它微生物中分离与其同源的核苷酸序列的探针。

本发明的另一个目的是提供一种制备β-淀粉酶的方法。