[发明专利]用于结合生物分子的、聚合物涂覆的基材及其制备和使用方法

说明书

                        与相关申请的交叉参考

本申请要求2004年11月24日提交的、发明名称为“用于结合生物分子的、聚合物涂覆的基材及其制备和使用方法”的美国专利申请10/996,952的优先权，该申请以引用的方式纳入本文。

                               背景技术

采用不依赖于标记的检测(label independent detection，LID)平台(例如表面等离子共振(SPR)或共振光栅传感器(resonant grating sensors))的试验通常以两步法进行：(i)将结合伴侣之一(通常是蛋白质)固定在传感器表面上；和(ii)将配体(药物、蛋白质、寡核苷酸等)结合在固定的蛋白质上。传统上，将生物分子偶联于表面包括把表面上的羧酸基团活化成反应性N-羟基琥珀酰亚胺((NHS))酯，然后将其偶联于感兴趣蛋白质上的氨基基团。Biacore，AffinityBiosensors和Artificial Sensing Instruments在他们各自的LID平台上成功应用该方法并将其商业化。虽然该方法很有效，但是活化步骤很耗费时间并且包括处理和使用具有一定毒性的化学品。

该方法的一种替代方法包括使用“预活化”化学物质。例如，已采用提供醛基的表面来结合生物分子。然而，偶联之后需要还原步骤来稳定产生的希夫碱。也采用了具有环氧化物和异氰酸酯官能团的表面；然而，环氧化物基团反应相对较慢，因此需要在碱性很强的条件下孵育很长时间，而异氰酸酯基团反应性极强，因此带来了储存稳定性方面的问题。因为这些问题，将预活化化学物质用于LID平台的报道很少见到。实际上，提供最流行的LID平台的三家公司-Biacore、AffinityBiosensors和ASI，提供的传感器都没有采用预活化化学物质(chemistry)。

马来酸酐易与亲核物质如氨基发生反应。虽然已描述了用马来酸酐共聚物层来修饰表面以固定小分子、DNA、糖和肽(1-9)，但由于马来酸酐的水解稳定性很差(10)，它们没有得到广泛应用。马来酸酐与疏水侧链(例如苯乙烯)共聚可增加马来酸酐的水解稳定性；然而，这会导致生物分子与表面的非特异性结合的问题。虽然这对于某些应用(如质谱)而言是一个优点，但对于LID来说则是一个问题。

大体而言，对于LID检测有一个独特的问题，即要求严格的生物特异性。不希望“阻断剂”(例如牛血清白蛋白，BSA)掺入分析物溶液中，因为特异性(由分析物引起)和非特异性(由阻断剂引起)结合均会导致界面折射率的变化，因此不能区分二者。当采用复杂的样品或者分析物不纯时，这个问题只会更加严重。对于用酸酐固定蛋白质的一个忧虑是由于形成残余负电荷以及聚合物中其它基团(例如苯乙烯、乙烯、甲基乙烯基醚等)的影响而导致的非特异性结合。因为这些原因，将酸酐聚合物用于LID的可行性也是一种潜在忧虑。这种忧虑以及酸酐基团的潜在稳定性问题是现有技术中还不知道或未描述将酸酐共聚物用于LID的一个原因。本发明描述了如何成功地将马来酸酐聚合物用于LID试验中。通过适当选择聚合物中的侧链和固定条件，这些结合试验可具有很高的特异性，同时保持足够的水解稳定性。而且，本发明公开了可在酸性(pH＜7)条件下将很多生物分子固定在马来酸酐共聚物表面上，同时相对于更加常规的肽偶联条件(pH7-9)，具有水解稳定性增加和蛋白质结合增加量等优点。

采用3D基质固定可以固定更大量的生物分子，因此提供了更多的结合位点。水凝胶如羧甲基葡聚糖是最常用的(32-34)。对于水凝胶的一个忧虑是在邻近表面的水凝胶中大分析物分子与结合位点的分离。相对于采用荧光显微镜等技术的常规检测，由于LID检测的瞬逝电磁场的指数性质，结合信号迅速从表面消失。本文描述的聚合物表面不如水凝胶厚，因此，固定发生在离界面更近的地方，这可防止在后续的结合研究中发生分离。

本文描述了用能够结合一种或多种生物分子的一种或多种聚合物涂覆的基材，及其制备和使用方法。使用这种涂覆的基材的方法相对于现有技术提供了多种优点。例如，这种基材不需要活化，从而节省了用户的时间、成本并降低了操作的复杂性。此外，这种涂覆的基材的制备方法允许大规模制备这种基材。一般，这种涂覆的基材具有稳定性，可储存较长的时间(～6个月)而其结合能力很少或不丧失。而且，这种涂覆的基材在酸性条件下水解缓慢，这允许在现有聚合物(例如酸酐聚合物)技术没有描述过的条件下结合各种生物分子。

                              发明概述