[发明专利]用全细胞催化剂制备光学活性醇

说明书

本发明涉及一种在存在全细胞催化剂(whole-cell catalyst)的条 件下，从酮开始制备光学活性醇的方法，所述全细胞催化剂包含醇 脱氢酶及能再生辅因子的酶，所述方法的特点是在>500mM的高底 物浓度下(不加入辅因子)进行。

光学活性醇制品用于例如制药业和食品业是令人感兴趣的。优 选的制备形式是通过在存在醇脱氢酶的条件下还原酮而获得光学活 性醇。这种酮的酶促还原已经在文献中详细描述。例如，参见M.-R. Kula，U.Kragl，Dehydrogenases in the Synthesis of Chiral Compounds in Stereoselective Biocatalysis(ed.：R.N.Patel)，Dekker，2000，Chapter28， p.839-866及J.D.Stewart，Dehydrogenases and Transaminases in Asymmetric Synthesis in Current Opinion in Chemical Biology2001，5， 120-129所述。在这方面也已知的是在反应期间消耗的辅因子的“再 生”方法。特别感兴趣的再生辅因子NAD⁺或NADP⁺的方法在于使 用另一种脱氢酶，特别是甲酸脱氢酶或者葡萄糖脱氢酶。使用全细 胞催化剂进行还原被证明是一种优选实施方式，因为与使用纯化形 式的或者其粗提物形式的分离的酶相反，使用全细胞催化剂无细胞 破裂和酶纯化的额外成本。同样优选的是使用重组表达系统，因为 这样可以达到高表达率。与非重组细胞例如面包酵母(baker′s yeast)比较，这种重组全细胞催化剂可以较少量应用。除了较高的 反应速度之外的进一步优点是避免了野生型细胞中含有的其他脱氢 酶进行的非所需的二级反应。使用已经通过重组DNA技术遗传修饰 的微生物的全细胞方法的优点见M.Kataoka，K.Kita，M.Wada，Y. Yasohara，J.Hasegawa，S.Shimizu，Appl.Microbiol.Biotechnol.2003， 62，437-445所详述。特别地，表达醇脱氢酶和用于辅因子再生的葡 萄糖脱氢酶的大肠杆菌(E.coli)细胞是特别合适的。

用有商业价值的高底物浓度进行还原一直特别具有挑战性。使 用其中存在ADH和葡萄糖脱氢酶的全细胞催化剂，甚至可以使用 >500mM的高底物浓度在两相反应系统(two-phase reaction system) 中产生光学活性醇。这特别在(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备中已经 被证实。然而，必需加入辅因子(在这种情况中是NADP⁺)以制备 这些醇。例如N.Kizaki，Y.Yasohara，J.Hasegawa，M.Wada，M. Kataoka，S.Shimizu，Appl.Microbiol.Biotechnol.2001，55，590-595所 述，NADP⁺的加入量基于使用的底物为大约0.001摩尔当量。因为 NADP⁺的价格较高，因此加入的辅因子即使量较少也会明显增加所 述方法的总成本。因此，不用“外来加入”辅因子的方法是有利 的。

基于作为辅因子再生酶的醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的活性而不用 加入辅因子的全细胞转化(通过全细胞转化底物)最近已经在A. Matsuyama，H.Yamamoto，Y.Kobayashi，Organic Process Research & Development 2002，6，558-561中描述。然而，使用的底物浓度低于 250mM(例如196mM和217mM)，并且需要17—48小时的较长反应 时间。使用基本上较高的底物浓度和短的反应时间(少于10小时) 的相应生物转化方法还未知。

对于全细胞方法，加入辅因子的意义也在N.Itoh，M.Matsuda， M.Mabuchi，T.Dairi，J.Wang，Eur.J.Biochem.2002，269，2394-2402 中描述。发现仅加入0.5mM的NAD⁺即达到满意的转化，而不加入 NAD⁺则几乎没有任何产物形成。在这方面，Itoh等发现“大肠杆菌 细胞中的内源NAD+/NADH不足以顺利进行反应”，伴随着必需 “外来”加入辅因子。

因此本发明的目的是揭示一种从酮制备光学活性醇的快速、简 便、低成本和有效的方法。