[发明专利]检测大环内酯的方法与系统

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2004年5月6日提交的美国系列号60/568,639的优先权，其内容全文纳入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及检测与定量大环内酯，例如红霉胺(erythromycylamine)和相关化合物的分析方法与系统，包括反相高效液相(RP-HPLC)和光度检测。

发明背景

大环内酯是用于治疗各种细菌感染的抗生素家族。大环内酯的化学特征在于14到16个原子和一般至少一个糖、氨基糖或相关部分组成的大环内酯环结构。据信，大环内酯与细菌50S核糖体上的两个位点结合导致转移RNA解离与肽连接终止，从而抑制了细菌蛋白质合成。红霉素是于1952年发现的第一个大环内酯类抗生素并且很快进入临床使用。红霉素和早期的衍生物(例如，不同的盐和酯)的一般特征在于对大多数革兰阳性细菌，特别是链球菌具有抑菌或杀菌活性，以及对呼吸道病原体具有良好活性。已证实大环内酯对许多呼吸道感染安全有效，并可用于青霉素过敏的患者。

大环内酯一般在非常低的波长范围(例如，＜220nm)具有紫外(UV)吸收，这接近光度检测方法的极限。红霉素(结构见下文)的美国药典国家处方集(USP-NF)的法定试验方法包括利用215nm紫外检测以L21固定相(反相，刚性，球状苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，5到10μm粒径)进行的RP-HPLC(参见，例如2000年1月1日出版的USP-NF的第663-665页)。事实上，许多还原的红霉素衍生物和相关分子，例如9-(S)-红霉胺(或PA2794，结构见下文)在远低于215nm具有最大紫外吸收带(UV_max)。例如，9-(S)-红霉胺的UV_max发生在约191nm，这接近标准光度检测方法的短波长极限。因此，例如电化学检测的替代检测方法是有吸引力的(参见，例如Whitaker等，J.Liq.Chromatogr.，(1988)，11(14)，3011-20；Pappa-Louisi等，J.Chromatogr.，B：Biomed.Sci.Appl.，(2001)，755(1-2)；Kees等，J.Chromatogr.，A(1998)，812(1+2)，287-293；Hedenmo等，J.Chromatogr.，A(1995)，692(1+2)，161-6；Daszkowski等，J.Liq.Chromatogr.Relat.Technol.，(1999)，22(5)，641-657和Dubois等，J.Chromatogr.，B： Biomed.Sci.Appl.，(2001)，753(2)，189-202)。然而，这些替代方法通常不适用于必须在质控环境中进行的试验，例如药物释放和稳定性研究的有关试验。为检测和定量所检验的化合物，例如活性药物成分，光度检测仍是较佳且广为接受的方法。

          红霉素                                                     9-(S)-红霉胺

因为当联用HPLC分析时光度检测明显优于＝其它检测方法，目前需要适当地设计利用紫外检测方法检测并定量低波长吸收的分子，例如大环内酯类抗生素的试验(方法)。本文所述的方法和系统有助于满足这个与其它需求。

发明简述

本发明提供了检测在约180nm到约220nm的紫外-可见范围具有最大吸收的大环内酯的方法，包括：

a)将含有所述大环内酯的样品施加至外部配有检测波长为约180nm到约220nm的紫外(UV)检测器的反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；

b)用含有离子对试剂的流动相洗脱所述样品；和

c)用紫外检测器监测柱流出液以检测位于检测波长的吸收峰或透射峰(transmission peak)，该峰对应于该大环内酯。

在一些实施方案中，所述大环内酯在约180nm到约200nm的紫外-可见范围具有最大吸收。在其它实施方案中，所述大环内酯是9-(S)-红霉胺。

在一些实施方案中，检测波长是约190nm到约210nm，约197nm到约205nm，或约200nm。

在一些实施方案中，该离子对试剂包括C₄-C₁₂烷基磺酸盐，例如1-辛磺酸钠。在其它实施方案中，流动相中该离子对试剂的浓度是约10mM到约30mM。

在一些实施方案中，该流动相还含有例如硫酸盐或磷酸盐的缓冲液。在其它实施方案中，该流动相的pH为约1到4，例如约为3。