[发明专利]抗病毒病的嫁接植株和生产相同植株的方法

说明书

发明领域

本发明涉及包括转基因抗病砧木和嫁接幼芽的抗病毒病植株和生产 相同植株的方法，其中转基因抗病砧木将抗病性传给幼芽。

发明背景

植物致病病毒导致全球农业鲜产品的重大损失。现代农业实践，包括 大地区种植单一植物和常年对鲜产品的需求导致的温室面积的增大，使病 毒传播和总损失增加的问题加重了。

过去人们成功的运用传统育种程序生产了抗病毒感染的植株。然而， 这些育种程序都依赖于抗病的自然资源，这些资源并非总能得到。比如， 全世界每年葫芦科植物都因小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)而受严重损害。 这种病毒通过叶蚜虫从一棵植物传到另一棵，杀虫剂不能有效地阻止这种 病毒的传播。而且，已经发现的抗病资源有限。

Powell-Abel等(Powell-Abel等，1986.Science 232：738-743)首次说明 转化并表达烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白(CP)基因的植株对TMV有 抗性。其后，指示用15种分类群中至少25种病毒获得了病毒外壳蛋白介 导的抗性，包括苜蓿花叶病毒，烟草脆裂病毒、马铃薯病毒X、黄瓜花叶 病毒(CMV)、马铃薯Y病毒及用马铃薯病毒X和马铃薯病毒Y两种病 毒外壳蛋白转化的植株。

通常，CP-介导的抗性与RNA-介导的抗性相比，对较大范围的病毒 菌株有效，但一般效果要差些，即，病毒RNA片段的在前者中的表达不 能翻译为具抗性的蛋白。举例说来，美国专利No.6,649,813揭示病毒诱 导的抗性会从植株的一代传到下一代，这种转基因植株包含取自病毒基因 组的复制酶部分的通读部分的编码序列，对病毒造成的随后的病害有抗 性。特别的描述了来自烟草花叶病毒(TMV)的54kDa编码序列的作用。 复制酶介导的抗性局限于具有高度序列同源性的菌株，不受这种具挑战性 的病毒的滴度的影响，和转基因表达水平不相关。

转录后基因沉默(PTGS)是一种序列特异保护机制，能同时靶向细 胞和病毒的mRNA，作为使基因表达失活的工具被广泛运用。已知PTGS 在植物中发生，然而一个接近的相关的现象，RNA干扰(RNAi)，已知 它在大范围的其他的有机体中发生(Baulcombe，D.2000.Science， 290：1108-1109)。已有结果指示RNA干扰发生在，例如线虫、粗糙脉孢 菌、黑腹果蝇和哺乳动物中。此外，转基因和病毒被揭示在植物中诱导基 因沉默，现在人们相信PTGS是一种抵抗病毒积累的天然防御机制 (Hamilton A.and Baulcombe，D.1999.Science 286：950-952；Matzke等， 2001.Curr.Opin.Genet.Dev.11：221-227)。

对于许多的植物RNA病毒来说，病毒诱导基因沉默(VIGS)被很好 的证实了。这个过程开始于双链的RNA(dsRNA)分子。dsRNA分子可 能由病毒RNA复制中间产物或者异常的转基因编码的RNA通过RNA- 依赖的RNA聚合酶活性变成dsRNA。一种属于核糖核酸酶III家族的酶将 dsRNA裂解成通常大小范围在21到26个核苷酸的短的干扰RNA (siRNA)。人们相信siRNA接着通过形成一个多成分的破坏同源mRNA 的多成分核酸酶复合体RISC(RNA诱导的沉默复合体)促进mRNA的降 解。自从发现了siRNA，基于这一机制的方法被用于使特殊靶基因沉默， 作为一个研究工具去揭示基因的功能和用于阻止不希望要的基因的表达。

WO 99/61631运用有义和反义RNA的基因片段揭露了改变植物靶基 因表达的方法。这些有义和反义的RNA片段能够配对并形成RNA双链 分子，因此改变基因的表达。

WO 99/53050揭示了在真核细胞中，特别是在植物细胞中减少感兴趣 的核酸的表型表达的方法和手段，其通过引入编码导向靶核酸的有义和反 义RNA分子的融合基因，能够通过区域与有义和反义核酸序列间的碱基 配对或者通过引入RNA分子本身形成双链RNA区域。

WO 00/68374涉及运用有义和反义RNA基因片段改变病毒基因在细 胞中的表达的方法。这些有义和反义RNA片段能够配对并形成双链RNA 分子，因此改变基因的表达。该发明还涉及运用该发明的方法获得的细胞、 植物或者动物，其优选地抵抗或者耐受病毒。