[发明专利]三磷酸脱氧核苷的生产方法

说明书

技术领域

本实用新型涉及三磷酸脱氧核苷的生产方法。

背景技术

三磷酸脱氧核苷是各种DNA聚合酶促反应的底物，是DNA序列分析、基因分析、定点突变、PCR(Polymerase Chain Reaction)、RT-PCR、反转录和DNA标记反应不可缺少的低分子量生物有机分子。而DNA序列分析、定点突变、PCR及DNA芯片技术是现代分子生物学、生物化学和现代生物医学研究不可缺少的技术。尤其是PCR技术具有操作简单应用广泛等特点，它在基因分子克隆、蛋白质工程、生物医药研发、遗传和传染性疾病诊断、法医鉴定、亲子检定等领域得到越来越广泛的应用。生物技术的快速发展及PCR在我国和欧美发达国家的广泛应用带动了对三磷酸脱氧核苷系列产品需求的迅速增长，产品市场前景非常广阔。

目前世界上只有少数几家企业能够生产三磷酸脱氧核苷，所采用的方法主要是利用脱氧核糖核酸水解产物的酶促或化学磷酸化，终产物的获得要求多步反应，生产工艺繁琐，产物转化率低，仅约25％。尽管世界上已有数家研究机构正在研发核苷酸还原酶，但这些正处在研发阶段的核苷酸还原酶大都具有要求反应条件复杂和酶稳定性差等缺点，并且只能将一磷酸或二磷酸核苷转换成相对应的一磷酸或二磷酸脱氧核苷。而一磷酸或二磷酸脱氧核苷不能直接作为DNA聚合酶的底物，应用范围有限。

发明内容

本发明的目的是为了克服传统三磷酸脱氧核苷生产工艺的不足，提供一种转化率高、工艺简单的三磷酸脱氧核苷的生产方法。

本发明所述的三磷酸脱氧核苷的生产方法，是将核苷酸还原酶EC1.17.4.2和要转化的底物ATP或CTP或GTP或TTP加入到反应系统中，使酶的浓度达0.01-0.16单位/ml，使底物浓度达到1-60mmol/L，并加入以维生素B12为基础的辅酶形式的辅酶，以及含巯基还原剂或NADH或蛋白质还原剂，以缓冲液控制溶液pH6-9，于25℃-40℃反应。

上述使用的缓冲液在反应溶液中的浓度优选为20-200mM；以维生素B12为基础的辅酶形式的辅酶优选辅酶B12，其在反应溶液中的优选浓度为0.005-0.045mmol/L；使用的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓糖(DTE)或二氢硫辛酸或巯基乙醇或还原型谷胱苷肽或其他含巯基还原剂等以及NADH和蛋白质还原剂，其中优选二硫苏糖醇(DTT)，其在反应溶液中的优选浓度为20-80mmol/L。

本发明是一种将三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP、TTP、UTP)转化为脱氧三磷酸核苷(dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP)的方法，具体就是利用重组核苷酸还原酶EC1.1 7.4.2催化还原三磷酸核苷使其转化为三磷酸脱氧核苷，可将四种三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP、TTP)一步直接转化成相对应的三磷酸脱氧核苷，其转化率接近100％，大大降低了生产成本，具有明显的创新优势和极强的市场竞争力。

具体实施方式实施例1

所用试剂包括：4mol/L的乙酸钠，1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，0.1mol/L的ATP或CTP或GTP或TTP，1mmol/L的辅酶B12，1mol/L的DTT。对于一个总体积为5ml的反应，分别向试管中加入0.4单位基因重组核苷酸还原酶，该酶的国际统一编号为：EC1.17.4.2，氨基酸残基数为756个，分子量为82KD。并加入上述的1.24ml乙酸钠、0.25ml磷酸盐缓冲液、0.5mlATP或CTP或GTP或TTP、0.1mlDTT和超纯水使得在加入辅酶B12后总体积达到5ml，最后在避光条件下加入40μl辅酶B12，用氮气快速冲刷试管(加样过程在冰浴上操做)。将上面加好样的试管移入25℃-40℃的恒温反应器中保温6小时即可停止反应进行终产物分离纯化。实施例2

所用试剂包括：1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，0.1mol/L的ATP或CTP或GTP或TTP，1mmol/L的辅酶B12，1mol/L的DTT。对于一个总体积为5ml的反应，分别向试管中加入0.4单位基因重组核苷酸还原酶EC1.17.4.2，上述0.75ml磷酸盐缓冲液、0.5mlATP或CTP或GTP或TTP、0.1mlDTT和超纯水使得在加入辅酶B12后总体积达到5ml，最后在避光条件下加入40μl辅酶B12，用氮气快速冲刷试管(加样过程在冰浴上操做)。将上面加好样的试管移入25℃-40℃的恒温反应器中保温6小时即可停止反应进行终产物分离纯化。