[发明专利]鼻咽癌恶性转化基因Tx基因DNA序列及其测定方法

说明书

本发明公开了鼻咽癌恶性转化基因Tx基因的DNA序列，属于人类恶性肿瘤分子生物学研究领域。

新近国内几个研究小组几乎同时发现上皮来源的肿瘤细胞表达免疫球蛋白。国外仅有一篇文章进行报道。即Kimoto报道：用敏感的巢式PCR技术发现癌上皮细胞中存在免疫球蛋白C区及TCR基因的重组，并进一步推测有相应蛋白的存在。但迄今为止，还未见报道在癌细胞中克隆到所表达的免疫球蛋白的基因。本发明首次从癌细胞中克隆了一个与免疫球蛋白kappa轻链基因高度同源的Tx基因，而且证明该基因具有恶性转化功能。本发明的鼻咽癌恶性转化基因Tx基因是世界首次克隆、测序获得的，并在美国基因数据库GenBank登录(登录号：AF269073)。

本发明的目的是通过所克隆的鼻咽癌恶性转化基因Tx，探讨癌细胞表达免疫球蛋白的机理以及调控Tx基因表达的因素，以阐述癌细胞表达免疫球蛋白的生物学意义，为细胞癌变机理的研究提供一条新的思路。

实现本发明目的的方法是首先克隆Tx基因的gDNA。将人鼻咽癌细胞株CNE2的gDNA打断成9-22kb的片段，重组到载体λDash，转染JB6细胞株，挑取在软琼脂上形成的阳性克隆，提取该阳性克隆的gDNA再转染JB6细胞株，经过这样的三次筛选后，将所获得的阳性克隆建立gDNA文库，用人的重复序列Alu作为探针，筛选此文库，得到一个长约16kb的gDNA序列，即Tx基因。

附图说明：图1为Tx基因的酶切图谱图。

以下对本发明基因进行克隆并测序方法作进一步说明。

Tx基因的克隆方法是：采用EB病毒阴性的CNE2鼻咽癌细胞系作为克隆恶性转化基因的来源。用含有7.5％胎牛血清(FBS)的BEM(基础Eagel`s培养基)培养CNE2细胞，提取该细胞的gDNA(15μg)，磷酸钙沉淀转染到2×10⁵受体细胞JB6中，转染一天，并培养三天后，将5×10⁴个细胞或2.4×10⁶个细胞重悬于含5％FBS的0.33％琼脂中，分别置于100-mm或60-mm培养皿中培养12天，计数大于8个细胞的克隆数，扣除阴性对照值(无DNA或无受体细胞DNA)即为停泊非依赖生长的阳性克隆数。从琼脂中挑取最大的细胞克隆，作为转染的细胞，再进一步进行克隆增殖。提取这些克隆的DNA并纯化以进行下一轮的转染。将提取的DNA中的16kb片段用脂质体法与pSV2共转染JB6受体细胞，新霉素抗性细胞选择性生长于含G418(500ug/ml)的5％TMEM中，培养2周，其间每三天换液一次，于0.33％琼脂中挑取3.6×10⁴抗性细胞即获得停泊非依赖生长细胞。传代3-4代的抗性细胞系重悬于含10％FBS的0.33％琼脂中，置于60-mm培养皿中。14天后，计数大于8个细胞的阳性克隆数。用Mbol将经过三轮转染的细胞的DNA作部分消化，通过蔗糖梯度离心法分离其中的9-22kb的片段，用T4连接酶用dGTP和dATP部分填平这些片段，另外用Xhol消化λdash载体臂(10ug)，纯化后，用dTTP和dCTP部分填平末端，将两者进行重组，(从而形成了Sal 1限制性酶切位点，这样有利于从载体中分离插入片段)用Gigapack Gold packaging extract(stratagene Inc.)包装此重组体，选择性转化p2392大肠杆菌。此未扩增文库容量为8×10⁶重组噬菌体。噬菌体经扩增后，此gDNA文库滴度为1.4×10¹⁰pfu/ml。

用人的Alu重复序列作为探针，筛选噬菌体文库，选取阳性克隆，用Sal 1完全消化其DNA，于凝胶中纯化16-kb的插入片段，将之命名为Tx基因(鼻咽癌恶化转化基因)。

所克隆的鼻咽癌恶性转化基因Tx基因进行序列测定的方法是：

将Tx基因分别用Sal I、Xho I、EcoR I进行酶切，获得五个酶切片段，分别是Sal I/Xho I Tx1.3，Xho I/EcoRI Tx3.0、EcoRI/EcoRI Tx 1.0、EcoR I/EcoR I TX2.8和EcoR I/Sal I Tx6.0。酶切图谱如图1所示。