[发明专利]从一种印度蚯蚓体腔液中得到的引起精子不能游动的蛋白

说明书

本发明涉及一种新颖的、从属于节肢动物门的蚯蚓Pheretima posthuma中分离到的、引起精子不能游动的蛋白，该蛋白可以作为抗致育因子。本发明还提供了从蚯蚓成熟样本的体腔分离活性因子的方法，可以由普通方式从属于节肢动物门的蚯蚓Pheretima posthuma获得成熟样本，该因子可以作为抗致育因子。

控制人口爆炸是与发展中国家(如印度、中国)的进步密切相关的重要项目。市场上有一些避孕工具和试剂，这无疑有助于控制生育和控制人口，但大多数避孕工具和试剂或存在成功避孕问题，或存在毒副作用问题，因为避孕药丸含有类固醇。因此，我们确实需要非常成功的装置或产品，既可保证成功避孕，又不会引起毒副作用。

因此，各个国家都在尝试得到这样的产品，但迄今为止，还没有一个国家获得成功。在日本有这样一个有趣的故事，东京大学的一位前名誉教授和一个调查小组开展了一项研究项目，研究从Eisenia foetida的体腔液中得到避孕物质。取自日本蚯蚓Eisenia foetida体腔液中的一种添加因子立即引起了包括人类在内的许多脊椎动物的精子游动停止。研究小组非常激动，继续纯化这种因子。他们发现该因子为一种蛋白质，并且是41kDa的单体蛋白质。此后，当他们又克隆出这种蛋白质的基因时，他们突然发现这种蛋白质具有很高的毒性(Sekizawa et al.，1996，Biomed.Res.，17(3)，197-203；Sekizawa et al.，1997，Gene，191，97-102；Yamaji et al.，1998，J.Biol.Chem.，273(9)，5300-5306；Kobayashi et al.，2000，J.Expl.Zool.，286，538-549)。将这些蛋白质注入老鼠的血液中，它们立即就死亡。在红细胞的制备过程中添加这种蛋白质后，瞬间即导致细胞溶解。这次事故虽然未能使达到他们的目的，但是他们却发现了这种蛋白质的另一面：即它具有抑制神经鞘磷脂的功效，神经鞘磷脂是存在于大多数脊椎动物细胞膜中的油脂。正是这种抑制力导致了细胞的溶解。不过，他们发现有一种像这些蛋白质一样重要的高效神经鞘磷脂抑制蛋白质，但目前还无法获取。这种蛋白质取名为“Lysenin”，因其所具有的神经鞘磷脂抑制功能而拥有极高的市场价值。该研究小组还发表了许多有关“Lysenin”的论文。

显然，他们未能实现自己的主要目标，即将其用作抗致育因子从而获得较高的商业利润。

本发明的主要目的是从一种蚯蚓的体腔液中鉴别出一种因子，该因子能引起精子立即停止运动，并能用作抗致育因子。

本发明的另一个目的是提供一种与当前市售的其它表现出严重副作用的避孕剂相比较，完全无毒的混合物。

发明人的工作始于印度蚯蚓Pheretima posthuma，抽提体腔液，并检测它们对精子活动性的作用，发现它能够与lysenin一样有效，同样立刻使精子停止运动。但二者存在着明显的差异。印度蚯蚓体内的抽提物并不会造成小鼠、老鼠及兔子死亡。针对该种毒性进行的详细、认真的试验表明其对肝脏及其他组织并无有害影响。此外，在RBC准备中添加它们后并没有像观察“lysenin”时出现细胞菌溶解现象。因此，该抽提物能够造成精子永久性地停止活动，而不至于产生任何副作用。在控制生育时使用这种优势可以带来巨大的商业利润。

这种因子同样也是蛋白质。申请人通过分子排斥色谱法(SG-100)将其加以净化。由此可以得出：它是从一种印度蚯蚓体内提取的产品，并且应该得到保护。

附图的简要说明

图1：体腔液经过SG100凝胶过滤柱的洗脱图，得到PI、PII、PIII三个峰。检测收集自每个峰的蛋白对精子活动性的作用。

图2：PIII(凝胶色谱的活性峰)经过HPLC DEAE柱的洗脱图。得到一个不连续的小峰(DI)、和三个连续的峰(DII、DIII、DIV)，检测收集自每个峰的蛋白对精子活动性的作用。

图3：离子交换层析步骤这的活性部分的SDS-PAGE电泳，12％的分离胶和3.5％的浓缩胶。约3μg的蛋白溶于20μl样品缓冲液中，样品缓冲液含有0.01MTris，10％SDS，5％β巯基乙醇和0.1％溴酚蓝(pH6.8)。100℃加热5分钟，加入凝胶，在50伏电压下电泳。7μl预先染色的标准参照物(GIBCO-BRL)用于确定分子量。得到20千道尔顿(kDa)的单体蛋白(图3)。

表格的简要描述