[发明专利]辽宁碱蓬胆碱加单氧酶基因及其克隆

说明书

本发明是辽宁碱蓬胆碱加单氧酶基因及其克隆，属于生物工程领域。特别涉及到辽宁碱蓬(S.liaotungensis kitag.)编码胆碱加单氧酶的基因及其克隆。

对非生物胁迫的普遍适应是积累与细胞代谢相容的有机溶质，广泛存在的最普遍的渗透物质是甘油、甘露醇、脯氨酸、蔗糖、海藻糖和铵的四价化合物。甜菜碱就是一类季铵化合物，在细菌、藻类、动物和多种植物中普遍存在，其中藜科、禾本科等植物在干旱或盐胁迫下甜菜碱的积累更为明显。甜菜碱除定位于叶绿体外还存在于微粒体和胞浆中。对细菌和植物的研究都表明甜菜碱的存在与耐渗透胁迫有关。甜菜碱起着无毒渗透保护剂的作用，它的积累使得许多代谢中的重要酶类在渗透胁迫下能保持活性。Saneoka等人证明，含甜菜碱的玉米在盐胁迫下比缺失型所受的损伤明显下降。甜菜碱是以胆碱为底物经两步酶催氧化生成，即：胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱。在高等植物中，催化第一步反应的是胆碱加单氧酶(choline monooxygenase CMO)，催化第二步反应的是甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase BADHE.C.1.2.1.8)。这两个酶的活性受盐和干旱胁迫诱导。目前只有极少数几种植物的胆碱加单氧酶基因被测序克隆。辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)是一种耐盐性很强的盐生植物，其胆碱加单氧酶活性较高。

本发明提供了辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)编码胆碱加单氧酶的基因CMO，提供了CMO cDNA全序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有CMO的克隆载体pUC19-CMO和含有这种载体的大肠杆菌(E.coli)JM109细胞JM109-pUC19-CMO。提供了CMO的植物表达载体pBI121-CMO和含有这种载体的大肠杆菌(E.coli)JM109细胞JM109-pBI121-CMO。利用本发明，可以进行植物基因转化，提高植物耐盐、耐低温及耐旱性。

本发明以菠菜(Spinacia oleracea L.)、甜菜(Beta vulgaris)的胆碱加单氧酶基因CMO核苷酸序列作参考，根据同源性较好的区域设计并合成两条寡核苷酸引物，提取辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)总RNA为模板，RT-PCR方法合成CMO的部分片段，并对此PCR产物测定核苷酸序列。根据此序列，在靠近5′端一侧设计一条反转录引物，两对嵌套PCR引物，5′RACE法合成CMO的5′端片段，对此片段进行PCR产物测序。根据第一个片段的序列，在靠近3′端一侧设计一条引物，3′RACE法合成CMO的3′端片段，对此片段进行PCR产物测序。这样获得了辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)CMO cDNA全序列，根据CMO cDNA全序列，设计两条引物，RT-PCR法合成CMO基因编码区，并将CMO基因编码区克隆到克隆载体pUC19，形成CMO克隆载体pUC19-CMO。热击法将这个克隆载体导入大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞，形成含有pUC19-CMO的大肠杆菌细胞JM109-pUC19-CMO。将pUC19-CMO和植物表达载体pBI121分别用限制性内切酶切割，形成互补的粘性末端，T₄DNA连接酶连接，形成CMO的植物表达载体pBI121-CMO，热击法将这个表达载体导入大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞，形成含有pBI121-CMO的大肠杆菌细胞JM109-pBI121-CMO。

辽宁碱蓬(S.liaotungensis kitag.)CMO cDNA核苷酸序列如下：

其中前面的小写字母表示5′端非编码区，中间大写字母为编码区(既开放阅读框架)，后面的小写字母表示3′端非编码区。为翻译起始密码，为翻译终止密码，为加poly(A)信号。