[发明专利]咔唑生物碱类细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂及其制备

说明书

本发明涉及一类新的用于细胞周期抑制和细胞凋亡诱导的组合物，特别是一类含咔唑生物碱衍生物的组合物及其制备。

咔唑类生物碱虽然有一些化合物已人工合成，但大多还主要来源于天然产物，而且对某些结构类型的咔唑类化合物已有人进行了部分生物活性的研究，如文献Tian-Shung Wu,et al,Carbazole alkaloids from Clausena excavata and their biological activity:Phytochemistry,Vol.43.No.1.pp133-140,1996及文献A.Chakraborty,et al,Carbazole alkaloid with antimicrobial activity from Clausena heptaphylla:Phytochemistry,Vol.38.No.3.pp787-789,1995曾报道这类化合物具有抗菌作用和血小板聚集抑制作用。但有关天然咔唑生物碱类化合物的生物活性至今未见有细胞周期抑制及细胞凋亡诱导等抗癌作用的研究报道。

天然咔唑类生物碱很多都来源于芸香科(Rutaceae)黄皮属(Clausena)植物。迄今该属植物化学成分的研究报道很多，主要成分为咔唑类生物碱和香豆素类化合物。同属植物黑果黄皮Clausena dunniana Levl在我国局部地区民间用于治疗癌症，但其化学成分特别是有关该植物抗癌活性成分的研究至今未见报道。

本发明的目的是研制一类新的用于细胞周期抑制和细胞凋亡诱导的物质，特别是一类咔唑生物碱衍生物及其制备。

本发明首次发现黑果黄皮的粗提物有很好的细胞周期抑制、细胞凋亡诱导及一定的细胞毒等抗癌活性，遂对其相关抗癌活性成分进行了系统的研究，并发现了下述四种结构类型的咔唑类生物碱，具有细胞周期抑制和细胞凋亡诱导作用，其结构如下：

用上述化合物作为主要活性成分，配之以药物可接受的辅剂、赋形剂，可以制成一类新型的细胞周期抑制剂和细胞凋亡诱导剂。

上述化合物的制备方法是用适量乙醇或含水乙醇溶液提取黑果黄皮茎皮的干燥碎块，得粗浸膏，将所得粗浸膏依次用有机溶剂萃取，得到提取物。将上述有机溶剂提取物经反复的硅胶和Sephadex LH20柱层析、反复的制备硅胶薄层层析和重结晶等分离纯化操作，分离出浸膏中的活性成分，得到上述四种结构类型的咔唑类生物碱活性单体。

本发明采用流式细胞术并配以细胞显微形态特征观察、荧光显微形态特征观察及颗粒粒度分析法，以对tsFT210小鼠乳腺癌细胞的细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及对该癌细胞的杀伤作用为主要指标进行了抗癌活性的筛选和测试工作。同时，采用HT-1080、K562等人癌细胞系，用MTT法检测了活性成分对人癌细胞的杀伤作用。结果表明，本专利所提供的上述四种结构类型的咔唑类生物碱在所测试的抗癌活性模型中均具有很好的相关活性。

本发明的咔唑生物碱类的作用特征是：或者通过抑制癌细胞的细胞周期周转，或通过诱导癌细胞发生凋亡，或者通过直接杀伤癌细胞发挥作用，上述咔唑生物碱类活性化合物也可作为生命科学的研究试剂～细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂用于探索生命现象。

实施例1分离制备1．药材的提取及活性部位的制备

黑果黄皮茎皮的干燥碎块5公斤每次用70％的乙醇15L回流浸提，共提取三次，每次4小时。合并提取液，减压浓缩，得粗浸膏300克。

将该浸膏用2500ml水分散，依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，分别收集各萃取液并浓缩。分别得石油醚提取物25克、氯仿提取物30克、乙酸乙酯提取物35克、正丁醇提取物60克和水溶部分150克。2．石油醚提取物中活性成分的追踪分离

取石油醚提取物25克，用30克硅胶G拌样，上减压柱(250克硅胶H干法装柱)层析，用石油醚(PE)-乙酸乙酯(EA)梯度洗脱分段，按极性粗分为20个流份，经活性测试及薄层检测后合并，得到6个组分：A组分1.5g(PE洗脱)，B组分6.35g[PE-EA(99∶1～97∶3)洗脱]，C组分6.25g[PE-EA(96∶4～95∶5)洗脱]，D组分1.25g[PE-EA(95∶5～93∶7)洗脱]，E组分0.35g[PE-EA(93∶7～92∶8)洗脱]，F组分9g[PE-EA(90∶10～50∶50)洗脱]。其中B、C组分活性以诱导凋亡和细胞毒为主，D、E组份活性以细胞周期抑制为主，A和F组分无活性。

B、C组分用硅胶G(1∶50)上常压柱，正已烷/丙酮95∶5洗脱，得到化合物7和8粗品5g和4.0g。