[发明专利]检测冻存生物样品质量的检测方法和装置

说明书

本发明涉及一种通过测定冻存生物样品降温曲线来检测其质量的检测方法和装置，特别涉及一种利用半导体制冷装置对冻存生物样品实施降温进而观察其温度随时间变化的降温曲线与该样品标准降温曲线之间的偏离度来定量检测冻存生物样品质量的方法和装置。

低温生物学是近年来新兴并得到迅猛发展的交叉学科，随着研究的深入，其在各行各业的应用引人注目。医学方面，冷冻保存医用生物材料并进行移植是当前低温医学中最活跃的领域之一。医用生物材料的冷冻保存包括：血液细胞、造血细胞、生殖细胞的冷冻保存；皮肤、角膜、骨与软骨、心脏瓣膜和大血管、内分泌腺以及器官等的低温保存。在农、林、医药、食品等行业中，低温生物学也为此带来了巨大的效益，比如在挽救濒危珍稀植物、保护生物等方面也产生了深远的影响。

生物材料可以在低温下长期保存，但却极易在对其降温和复温过程中受溶液冻结、融化，以及溶液渗透压力变化等因素的作用而损害。因而，在各类生物样品的冷冻与复温过程中，一方面，建立合适的降温程序是成功保存生物材料的关键因素，另一方面，成功的冻存技术还必须包括对冻存的生物材料质量进行快速、准确的检测，否则该冻存技术就没有普及推广意义。比如，快速、准确测定冻存后的胎肝细胞的活力，是胎肝细胞冷冻保存中的重要问题，因为这关系到该胎肝细胞能否进行移植和移植后能否重新建造造血功能(刘金刚，刘作斌主编，低温医学，北京：人民卫生出版社，1993)。所以，对冻存生物材料质量的的检测在低温生物医学的研究和应用中必不可少。

在刘金刚和刘作斌主编的低温医学(北京：人民卫生出版社，1993)及李广武、郑从义和唐斌主编的低温生物学(长沙：湖南科学技术出版社，1998)中，就各种冻存生物样品质量的检测方法进行了介绍：

对冻存卵胚胎活力的检测方法包括：

1.形态学观察：将冻存后复温的胚卵置于实体显微镜或相差显微镜下，观察胚卵的透明带是否完整、卵裂球轮廓是否清晰，大小是否均匀，是否晶莹透亮；有无变性(即胞质呈细颗粒状，轮廓模糊)、卵周间隙增大等。但这种观察只能对复温后的胚卵状况作出初步判断，而且，检定结果难免因人而异，在定量和客观性方面差。

2.冻存后胚卵进行体外培养，根据不同发育阶段的形态改变而计算出体外发育率。显然，这一过程操作周期长，复杂繁琐。

3.胚胎移植：将冻存后复温的胚卵进行胚胎移植，观察胚胎体内发育情况，如受体的妊娠率，胚胎的植入率，产仔率等。该检定程序也相当费时，且操作并非易事。

4.快速荧光活体试验，但操作复杂，仪器昂贵。

对冻存红细胞质量检测分体外和体内检测两种方法(刘金刚，刘作斌主编，低温医学，北京：人民卫生出版社，1993)包括：

体外检查方法：红细胞形态、计数、血红蛋白含量、糖、乳酸、有机磷化物转变为无机磷化物(ATP)2，3-DPG和K⁺，Na⁺的分布等，它们均涉及到一系列复杂的操作程序及昂贵仪器。国内常用的方法还有将ATP、2，3-DPG和红细胞酵解法(无氧酵解能力的测定)等通常酵解法作为判断标准，其方法是将正常人新鲜红细胞或者保存红细胞，用含糖的Tris-HCl任氏液洗涤3次后，取一定量洗过的红细胞悬液于华伯(Warburg)仪反应瓶中，在华伯仪恒定的条件下[温度38±0.10℃，pH7.43-7.46，无氧状态(N₂)，振荡100±2次/每分钟，孵育5小时]进行重营代谢，观察孵育5小时过程中所消耗的葡萄糖量以及产生的乳酸量，以判断红细胞的无氧酵解能力，从而估计红细胞的质量。显而易见，该过程也相当繁琐。

冻存红细胞质量的体内检查法是：一定量的保存红细胞输入体内后，有些在输注后是不能活的，这些丧失了生理功能的红细胞在受血者身体里24-48小时内消失，因此可以通过红细胞输入体内一定时期后存留于血流中的成活细胞的百分比，即所谓输注后的存活率来估计保存红细胞的质量。测定红细胞在体内存活率的方法有同位素标记法和免疫法。同位素方法常用⁵¹Cr法，其标记物是放射性铬，一般以铬酸盐形式使用，这种化合物的阴离子在体外能迅速地被红细胞摄取，进入红细胞后，铬从六价被还原为三价，以此形式与细胞内血红蛋白分子紧密结合。但超量的铬酸盐会对红细胞产生明显的损伤。所以此法并非理想。