[发明专利]选择性电融合至少两个具有细胞样膜的融合配偶体的方法

说明书

                      发明领域

本发明涉及一种用于对具有细胞样膜的至少两个融合配偶体进行选择性电融合的方法。

                      发明背景

电融合业已发展成为极其有效的融合哺乳动物细胞的方法，这主要是因为它的温和条件，它能得到大量有生活力的融合产物[例如，参见White，K.L.1995，哺乳动物细胞的电融合，分子生物学方法，48，283-293]。对磷脂双层膜施加电场，当所施加的势能达到或超过膜的裂解势能时，会诱导孔的形成。因此，业已将电渗透技术用于多种生物学实验中，如通过电融合产生杂交瘤和新的细胞系[例如，参见Zimmermann，U.等，1985，电融合：新型杂交技术，优势生物技术进展4：79-150；Neil，G.A.等，1993，电融合，酶学方法，220，174-196；Glassy，M.1988，产品综述：通过电融合产生杂交瘤，自然，333，579-580]，体外受精[例如，参见Ogura，A.等，1995，精子细胞作为雄配子，繁殖受精发育，7，155-159]，克隆实验[例如，参见VanStekelenburg-Hamers，A.E.P.等，1993，在牛的体外成熟的/体外受精的胚胎中进行核转移和电融合：培养基和电融合参数的作用，分子繁殖发育，36，307-312]，为了导入细胞临时的溶质而进行的细胞电穿孔[例如，参见电穿孔：用于操纵细胞和组织的一般现象，细胞生物化学杂志，51：426-435；Li，H.等，1997，通过电穿孔转染大鼠脑细胞，神经科学方法杂志，75，29-32；Lundqvist，J.A.等，1998，通过超微电极改变单个培养细胞和细胞器的生物化学状态，美国科学院院报，95，10356-10360]，和用于增加包括蛋白在内的膜相关大分子的电插入[例如，参见Mouneimne，Y.等，1989，将异种-血型糖蛋白电插入到红血细胞膜中，生物化学生物物理学研究通讯，159，24-40]。体内电融合的应用包括将来自人HL60细胞的淋球菌结合受体整合到兔角膜上皮组织上，作为人专一性病原体的活的模型[例如，参见Heller，R.，1990，通过体内细胞组织电融合将人细胞结合到完整的动物组织中转移人膜表面成分，生物化学生物物理学学报，185-188]。

电场诱导的融合被广泛应用于悬浮的细胞群体的生物学研究。首先通过施加低幅度、高频率交流电场通过介电泳让细胞接触，然后通过一个强而短促的直流脉冲使一部分细胞融合。与大量细胞进行大规模的电融合可用于产生并筛选新的细胞系，但不能用于以高的精确度融合单细胞。这会导致来自相同细胞系的细胞之间的不希望的融合，以及来自不同细胞系的细胞之间的希望的融合。另外，大规模电融合不能够控制要融合在一起的细胞的数量，这会导致不希望有的双核至多核融合产物的出现。

                        发明概述

通常需要选择性地和可操纵地改变单细胞的生物化学和遗传学特性。为了解决这种挑战并克服大规模融合的缺陷，本发明人业已开发了一次将一对细胞融合在一起的技术。可操纵地将单细胞融合在一起的能力代表了这样一种技术，通过这种技术可以精确地操纵特定细胞的长期遗传学性质和表型，并提供了产生杂合的和克隆的细胞的组合文库的新的克隆。通过与有效的测定和成像技术结合，可以详细研究单细胞的遗传学和生物化学性质。

细胞特性的改变还可以通过将合成的磷脂小泡与所需要的小泡成分和膜的组成与靶细胞融合在一起而实现。该技术可用于改变单细胞的成分和膜特性。例如，可以将在脂质体中重建的膜蛋白导入细胞质膜中。这种选择性地转移单细胞的膜组成的能力预期具有生物学用途，如导入表面受体，以便筛选潜在的配体和相关的药用化合物。

因此，本发明提供了一种用于选择性电融合诸如细胞和脂质体的细胞结构的新的方法。该方法具有以下优点：细胞选择，以高的空间分辨率融合粘接细胞结构，提供了产生复杂的细胞网络的可能性。由于电融合是一种温和的方法，这种小型化的形式可用于，例如，在单细胞水平上进行克隆，并用于体外受精。特别是对于克隆实验来说，大规模电融合的缺陷通过本发明的技术得到克服，因为它可以全面控制融合过程以及有关需要产生的体细胞的性质的任何疑问。另外，该方法优选与微机芯片技术结合，可用于产生克隆细胞或杂合细胞的筛选文库。

通过以下说明和所附权利要求书可以了解本发明的特征。

                     附图简述

下面的说明书和实施例是结合附图进行的，其中：