[发明专利]用于单端孢菌毒素真菌毒素检测的方法和试剂

说明书

技术领域

本发明涉及农作物，食物，饲料等中的单端孢菌毒素(trichothecene)真菌毒素的免疫测定，涉及用于免疫测定的试剂和试剂盒，以及其中使用的单克隆抗体。

背景领域

真菌毒素被定义为真菌(经由食物或饲料对人类或动物有一些有害效应的)产生的次生代谢物，并区别于细菌毒素及其诸如此类的毒素。真菌毒素，不同于细菌毒素，是低分子量物质，包括各种已知物质。在其化学结构和对生活的有机体有害效应方面有相当的变化。不只是一些真菌毒素对人类有害；某些在人体中表现高的急性毒性，其它的被认为在肾和肝脏具有致癌性或致瘤性。由于其低分子量，真菌毒素在食品加工或烹调的一般条件下很难分解或除去。而且，当通过饲料摄取进入食用动物体内时，真菌毒素的高稳定性使其保留在这些动物的肉与牛奶产品中，当摄入人体之后最终表现出毒性。

真菌毒素污染能通过各种途径发生，但广义上被分为作物的初级污染(在作物的栽培，收获，储藏和加工过程中通过真菌的侵染发生)和家畜和海产品(例如，肉，奶，蛋)的次级污染。根据诸如作物种类(真菌的底物)，存在于栽培环境中的真菌种类以及环境条件(例如，温度，湿度和降雨量)的因素，初级污染表现出局部特征。

单端孢菌毒素真菌毒素是污染主要的禾谷类作物(如大麦，小麦，黑麦，燕麦和玉米)的代表性真菌毒素。脱氧瓜萎镰菌醇(DON)，瓜萎镰菌醇(NIV)，T-2毒素(T-2)是代表性的单端孢菌毒素真菌毒素。主要产生它们的真菌，禾谷镰孢、黄色镰孢、拟枝孢镰孢，一般存在于土壤中，如果自然条件如温度，湿度以及降雨满足的话，容易侵染农作物，导致传播农作物的真菌毒素污染。为了防止食品和饲料的污染，许多国家正式通过了关于食品和饲料中的单端孢菌毒素真菌毒素残余浓度的法规。因此，迅速和准确地测定食品和饲料中的单端孢菌毒素真菌毒素是很重要的。

以前用于测定单端孢菌毒素真菌毒素的方法包括层析，高效液相色谱，气相色谱，质谱和使用动物的生物测定，这些方法以单独地或结合的方式进行测定。而且，最近提出的免疫测定开始使用。免疫测定(是迅速和简单地执行分析的方法，具有非常好的特异性和灵敏度)被广泛地应用于各个领域，包括测定激素和生物物质。尤其，用于制备单克隆抗体的技术促进了免疫测定方法的较大进展。

也存在一些单端孢菌毒素真菌毒素的衍生物，它们也具有毒性。因此，为了了解单端孢菌毒素真菌毒素污染的程度，优选地是以某些共同地而不是个别地测定这些衍生物。测定的实验材料包括非常广泛范围的物质，例如，如受单端孢菌毒素真菌毒素侵染的大麦，小麦，黑麦，燕麦以及玉米的禾谷类，用感染的禾谷类饲喂的家畜的肉和奶，从感染的肉和奶产生的加工的食物。而且，由于在加工过程中真菌毒素的浓度被稀释，有必要测定低浓度的单端孢菌毒素真菌毒素。因此，需要一种具有较高灵敏度的测定方法。

另一方面，为了了解污染的地点和情况，单独地测定3种主要的单端孢菌毒素真菌毒素DON，NIV和T-2是重要的。为了建立能够测定这些单端孢菌毒素真菌毒素的免疫测定，将有利地使用对欲测定的单端孢菌毒素真菌毒素具有高亲和性和高特异性的抗体，尤其是单克隆抗体。

在各种出版物中公开了单端孢菌毒素真菌毒素的单克隆抗体。日本出版检查的专利申请43358/93公开了对T-2具有特异性的单克隆抗体和用抗体对T-2类型测定的方法，该单克隆抗体是通过用一种免疫原(通过把T-2结合到一种载体蛋白上制备的)免疫老鼠而获得的。Dietrich等获得了T-2的单克隆抗体和3-乙酰DON的单克隆抗体(天然毒素，3：288-293，1995)。美国专利4879248公开了在第8个位置上使用取代基作为接头，通过结合一种载体蛋白产生抗体。然而，这些出版物都没有公开适合于本发明的对象的具有高亲和性和特异性的单克隆抗体。

应用和环境的微生物学，1993年5月，59：1264-1268公开了4，15-二乙酰NIV的多克隆抗体(通过使用一种免疫原制备，其中载体蛋白质结合在第3-位置的碳原子上)，但没有公开利用类似的免疫原产生单克隆抗体。此外，T-2和DON的单克隆抗体在食品添加剂污染(5：629，(1988))和农业食品化学杂志(36：663(1988))中予以公开。

根据本发明的单克隆抗体具有下列特征，并且优于以上提及的已知的单克隆抗体。