[发明专利]代谢控制的工程化

说明书

发明背景

重组DNA技术的应用使得可工程化宿主细胞，以产生所需的化合物，如多肽和次生代谢物。在工程细胞中大规模生产多肽使得可生产具有药学用途的蛋白质和具有工业用途的酶。次生代谢物是来自自然界的产物，长久以来已知其生物学和医学重要性。由于这种分子固有的结构复杂性，传统的化学合成通常需要大量人力并使用昂贵的前体和辅因子以制备该化合物。近年来，在细胞中表达异源蛋白已经促进在生物中异源生物合成途径的工程化，以从非昂贵的起始材料生产代谢物。以此方式，已产生了许多化合物，包括聚酮化合物，β-内酰胺抗生素，单萜，类固醇，和芳香化合物。

发明概述

本发明部分基于如下发现，即可通过使用受次生代谢物如乙酰磷酸浓度调节的启动子调节多肽(如生物合成酶)的表达，而增加异源多肽和代谢物的产生。术语“异源”是指多肽或代谢物是通过人为导入的。异源多肽或代谢物可与天然存在的内源性物质相同。术语“代谢物”指是一或多个生物化学反应的产物的有机化合物。代谢物其自身可以是其它反应的前体。次生代谢物是产生自另一代谢物的代谢物。

因此本发明一方面涉及一种含有一核酸序列的细菌宿主细胞，该核酸序列包含一个启动子和一个编码异源多肽的核酸序列。细菌宿主细胞例如包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，根瘤土壤杆菌，嗜热水生菌，和豌豆根瘤菌细胞。此核酸序列可操纵地与由应答调节蛋白控制的启动子连接。换而言之，核酸序列与启动子的连接方式是使核苷酸序列在体外或体内表达。“启动子”是指导遗传物质转录的任何DNA片段。启动子是由应答调节蛋白控制的，例如大肠杆菌的ntrC，phoB，phoP，ompR，cheY，creB，或torB，或其它细菌菌种的同源物。另外，应答调节蛋白可以是簇合直向同源组(cluster orthologous group，COG)COG0745的另一成员，其由http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所定义(Tatusov等，核酸研究(2000)；28：33-36)。在一实施方案中，启动子是与大肠杆菌ntrC结合的。术语“ntrC”是指大肠杆菌ntrC蛋白(SWISSPROT：P06713，http：//www.expasy.ch/)及在其它适当细菌中的同源物。本文所用“结合”是指平衡结合常数(K_D)小于100nM，优选小于1nM的物理缔合作用。一适当的启动子例如是大肠杆菌glnAp2启动子，如以GenBank登记号No.M10421公布的DNA序列的大约93-323位之间的区域(Reitzer & Magasanik(1985)美国科学院院报82：1979-1983)。此区域包括glnA基因的未翻译序列。另外，可在glnA编码序列和异源多肽的编码序列之间构建一翻译融合体。

宿主细胞被遗传修饰从而启动子由乙酰磷酸在无氮饥饿的情况下调节。例如，宿主细胞可通过缺失或突变编码组氨酸蛋白激酶的基因而遗传修饰，例如，该组氨酸蛋白激酶是COG0642的成员(如由http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所述；Tatusov等，如前)，例如glnL，phoR，phoQ，creC，或envZ。在另一实施例中，组氨酸蛋白激酶对控制启动子的应答调节蛋白有特异性。组氨酸蛋白激酶可由glnL，如大肠杆菌glnL(SWISSPROT P06712，http：//www.expasy.ch/)编码。

尽管宿主细胞被遗传修饰从而启动子由乙酰磷酸在无氮饥饿的情况下调节，以表达异源多肽或代谢物，但宿主细胞可在任何所需条件下繁殖，例如在氮饥饿条件，氮缺乏条件，或氮富足条件下繁殖。

由此核酸序列编码的异源多肽可以是产生代谢物所需的生物合成酶，其可以是哺乳动物蛋白，例如分泌的生长因子，单克隆抗体，或胞外基质组分。在另一实施例中，异源多肽可以是用于疫苗中的所需抗原，例如来自病毒，细菌，真菌或原生动物病原体的表面蛋白。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其含有一种核酸序列，该核酸序列包括由应答调节蛋白控制的启动子。此试剂盒还任选的含有已经遗传修饰的细菌宿主细胞，从而启动子在不存在氮饥饿情况下由乙酰磷酸调节。此试剂盒还可提供使用说明。所述核酸序列可含有位于启动子3’端的限制酶多接头，这样插入多接头的序列与由应答调节蛋白控制的启动子可操纵地连接。在该试剂盒的一实施方案中，启动子是大肠杆菌glnAp2启动子，细菌宿主细胞是含有glnL基因缺失或突变的大肠杆菌细胞。