[发明专利]分离细胞质级分而不影响卵母细胞和胚胎细胞活力的方法

说明书

                       技术领域

本发明涉及一种从卵母细胞中分离细胞质级分而不会影响卵母细胞受精能力的方法。本发明还涉及一种从胚胎细胞中分离细胞质级分而不会影响该细胞发育潜能的方法。

                      背景技术

用于分析卵母细胞细胞质的方法需要破坏卵母细胞。因此，尽管在分析中提取的信息可能特别令人关注，但是研究者不能够将卵母细胞作为完整的细胞单位根据从分析中提取的信息进行进一步研究。此外，随后不能够使卵母细胞受精并使之发育成胚胎、胎儿和婴儿。

存在对研究卵母细胞中胞质机制而不影响卵母细胞受精能力的方法的需求。还存在对研究胚胎细胞中胞质机制而不影响该细胞发育潜能的方法的需求。可以将这些方法用于研究卵母细胞或胚胎细胞中的那些由线粒体介导并且是卵母细胞或胚胎细胞或来源于受精卵母细胞或胚胎细胞的子代中的功能异常或疾病的原因或怀疑可导致这些情况或与这些情况相关的机制。

                       本发明的描述

本发明试图满足这些需求且在第一个方面中提供了一种从卵母细胞中分离细胞质级分而不会影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括包括从卵母细胞中释放细胞质级分的步骤。从卵母细胞中释放的细胞质级分的体积约占该卵母细胞体积的5％。优选该体积约占所述卵母细胞体积的2％。

在本发明第一个方面的一个实施方案中，所述的方法包括下列步骤：

(a)将释放装置插入卵母细胞；

(b)将约占卵母细胞体积5％的细胞质级分抽入释放装置；和

(c)从卵母细胞中抽出释放装置而使所述级分从释放装置中分离出来。

抽入释放装置中的细胞质级分的体积一般小于10pL且优选8pL。优选释放装置包括至少一种ICSI移液管且优选将细胞质级分抽入移液管内约(100μm)。

从卵母细胞抽入释放装置中的细胞质级分一般在释放装置与卵母细胞之间形成细胞质内含物的挤出物。通过缓慢拉伸或剪切挤出物以分离挤出物而从卵母细胞中分离细胞质级分。优选通过拉伸挤出物而分离细胞质级分。

一般来说，细胞质级分含有胞质细胞器且包括卵母细胞线粒体和线粒体产物的样品或由它们组成。

位于卵母细胞中的线粒体是一种模板，从受精卵母细胞中发展而来的子代内所有的线粒体来源于该模板。本发明者认为用于从卵母细胞中分离细胞质级分而不影响卵母细胞受精能力的方法能够研究线粒体基因组的完整性与卵母细胞和由受精卵母细胞发展而来的子代的功能之间的相关性。

因此，在第二个方面，本发明涉及一种分析卵母细胞中线粒体基因组而不影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括下列步骤：

a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；

b)分析级分中线粒体的线粒体基因组。

线粒体基因组突变可导致功能异常或疾病或至少与此相关。例如，可以理解来自线粒体基因组8470位-13,446位核苷酸的核苷酸序列缺失即所谓的“5kb共同缺失”与克-塞综合征(KSS)和慢性进行性外眼肌瘫痪(CPEO)相关。可能或不可能因共同缺失而观察到的导致疾病的其它缺失包括脑和心脏线粒体基因组中的7.4kb缺失和10.4kb缺失/插入以及各种点突变。在包括骨骼肌、心脏、脑、卵母细胞、白细胞、视网膜和卵巢在内的人体组织中也观察到了这种缺失。

线粒体基因组中超过40个致病性点突变可能与涉及中枢神经系统、心脏、肌肉、内分泌系统、肾脏和肝脏的较广范围的退化性疾病相关。与点突变相关的疾病包括利氏综合征、MELAS(线粒体性脑肌病、乳酸中毒和中风样发作)、MERRF(伴有深红(ragged-red)纤维的肌阵挛性癫痫)、NARP(神经病、运动失调和色素性视网膜炎)和LHON(利伯氏遗传性视神经萎缩)。

一种从卵母细胞中分离细胞质级分而不影响卵母细胞受精能力的方法因卵母细胞与由受精卵母细胞发展而来的子代的功能完整性而用于检测线粒体基因组中的核苷酸序列突变、能够研究核苷酸序列、多态性或突变。

因此，在第三个方面中，本发明提供了一种检测位于卵母细胞线粒体内的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变而不影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括下列步骤：

a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和

b)对细胞质级分中线粒体的线粒体基因组核苷酸序列分析线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的存在。