[发明专利]葡萄糖脱氢酶融合蛋白及其在表达系统中的用途

说明书

本发明涉及包括一种具有葡萄糖脱氢酶(GlcDH)的生物活性的蛋白序列作为一种成分的新重组蛋白，并且涉及其用于简单的和有效的检测任何优选地作为融合伙伴的蛋白/多肽的应用，以及快速优化能够表达所说的蛋白/多肽的表达系统的用途。

在这方面，GlcDH或具有GlcDH的生物活性的序列承担标记物或检测器蛋白的作用。此酶的一个特别的特征是对诸如SDS的变性剂的异常的稳定性。GlcDH作为标记物或检测蛋白，甚至在还原和变性条件的SDS-PAGE之后表现不减少的酶活性。因此，使用一种基于这一令人惊讶之行为的敏感性酶反应，可以检测包括GlcDH的融合蛋白。因此，以GlcDH作为标记物，快速地、低成本地和有效地检测所要求的表达蛋白是可能的。

在许多情况下，GlcDH-蛋白/多肽融合蛋白以比没有GlcDH更高的产量和稳定性表达，也是可能的，特别是在E.coli中。因此，相应的蛋白本身可被用于获取和制备蛋白/多肽。

重组蛋白的体内表达在生物技术中发挥的作用正在不断增加。从诸如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞的原核和真核表达系统获取、纯化和检测所克隆的基因的产物的能力，也经常被用于蛋白结构和功能的研究，蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用的研究，以及抗体生产和突变。借助于DNA重组技术特异性地修饰天然蛋白从而改善或改变其功能是可能的。重组蛋白在被连续地深入发展的，并且在此系统中许多不同地方可以被优化的表达系统中合成。

重组蛋白合成的总过程可被分成两部分。在第一步中有该基因的分子生物学分离和该靶蛋白的表达，在第二步中有从重组细胞或其生长培养基检测和纯化。在分子水平上，将蛋白的基因克隆到为此目的所提供的表达载体中，然后插入宿主细胞(原核或真核细胞)并在其中表达。细菌细胞在此线路中被证明是提供高产量的简单的和有成本效益的表达系统。最常使用的宿主细胞是革兰氏阴性细菌E.coli。

外源基因在E.coli中表达的目标是获得最大可能量的生物活性重组蛋白，这被称为超量表达。已知真核外源蛋白在此期间可能通过聚集，作为包函体，通过不正确的折叠或蛋白水解性降解，失去其生物活性。避免这些经常出现的困难的一种可能，是所表达的蛋白作为分泌蛋白从细胞排出，或者使用所谓的融合蛋白，通过它不溶性重组蛋白可以可溶性形式存在于细胞中。

为了研究蛋白的功能和其对此功能重要的相互作用伙伴的功能，通常在真核细胞中表达蛋白。对此功能重要的翻译后修饰，和正确的区室作用可以在其中进行。此外，存在对正确折叠和加工重要的其它蛋白。

真核表达系统也适合于表达相对大的蛋白和正确折叠要求诸如S-S桥形成、糖基化和磷酸化等转录后修饰的蛋白。因为这些系统通常是复杂而昂贵的，并且表达速率低于E.coli的表达速率，所以拥有一个快速、可靠、敏感和价格合理的检测系统特别重要。

存在众多检测已经通过重组形成的，并且其生物功能未知的外源蛋白的基因融合系统。在这些中，所表达的融合蛋白经由功能已知的融合蛋白部分来检测。

为了确定正确的表达、所表达的量、分子量和所形成的融合蛋白的功能活性，一种敏感的检测系统是必要的。功能未知的蛋白的数量正在快速地增加，为其开发快速和有成本效益的检测系统正变得越来越重要。对于多数基因融合系统，使用了诸如酶联免疫吸附试验(ELISA)或Western印迹的免疫学方法，其中通过重组形成的融合蛋白借助于特异性抗体检测。

然而，相应的融合蛋白不仅有所述的优点，即外源蛋白可容易地间接检测和分析；相反地，在许多情况下，他们允许所要求的蛋白以比没有其融合伙伴之情形更高的产量表达。每一种融合伙伴都有优点，在一个特别的表达系统中，不是不常见能够将其转移给另一种融合伙伴。因此，例如，一些蛋白对蛋白水解性[sic]降解的敏感性，当它是融合蛋白之形式[sic]时，可被降低。与单个成分比较，融合蛋白还常常具有比单个成分更良好的溶解性和分泌特性。

因此，有许多在异源宿主中进行基因融合表达重组蛋白的原因。这些原因有：提高外源蛋白的溶解性，提高可溶性外源蛋白的稳定性，将外源蛋白定位在细胞的特定部分，利用已简化的纯化策略快速分离外源蛋白，融合蛋白被特异性切除的可能性，快速检测来自未纯化的细胞提取物的外源蛋白。

当前，有许多借助于基因融合系统测试重组蛋白表达的功能测试。这些包括通常使得从未纯化的细胞提取物的直接检测成为可能的简单测试。然而，测试系统在花费的时间、处理量和敏感性上有相当的差异。