[发明专利]雪旺细胞源神经营养因子及其制备方法

说明书

本发明涉及一种雪旺细胞源神经营养因子及其制备方法。

全世界每年有大量的周围神经损伤患者，占外伤病人总数的6％。尽管今天显微外科技术已使神细修复达到了极高的精确度，又细胞外科技术等，但疗效仍不满意，优级的效果只有50％，说明有必要从神经生长的内在机制寻找解决途径。

50年代，Levi-Montalcini和Cohen发现了神经营养因子(NGF)，开创了神经研究的新领域。至今已经半个世纪，但中枢神经损伤后仍不能再生。1979年Lundborg发生再生室的研究方法后，在研究周围神经再生方面才有突破，周围神经损伤后，可以再生。形态学研究表明周围神经是神经细胞的伸延部分。周围神经损伤后，会发生变性，神经的远侧断端的轴突和髓鞘均崩溃和吸收，唯有雪旺细胞反而大量增殖，有独特的分泌功能及形成独特的膜管结构(Aguayo，AJ1981)，“迎接”新生的轴突，并给予营养，促进其再生。这表明了雪旺细胞在神经损伤后修复中的主导地位和作用。

本发明的目的在于提供一种雪旺细胞源神经营养因子及其制备方法，其对脊髓运动神经细胞有很好的营养、存活作用和保护免受毒害、损伤的影响，对周围神经的再生有促进作用。

本发明之雪旺细胞源神经营养因子为一种酸性蛋白质，分子量为50～58KD，等电点为4.55。其制备方法为：(1)雪旺细胞的分离、培养和收集：把大鼠体内预损伤的周围神经或新生大鼠的周围神经取出，去掉其外膜，剪碎，用酶溶法处理后，进行细胞培养，用差速粘附法把成纤维细胞分离出来，纯化雪旺细胞，用无血清培养，以排除来自血清的细胞因子的影响，最后培养出纯度达95％的雪旺细胞；(2)提取雪旺细胞源神经营养因子：把雪旺细胞的无血清培养液或用超声捣碎细胞的上清液进行超滤收缩、收集＞10Kda分子，然后用SephadexG-100凝胶层析作初步分析，分段收集几个组分，把对脊髓前角运动神经元生物活性最好的一个组分、再上高效液相色谱(HLPC)分析，最后收集到一个对脊髓前角运动神经元生物活性最好的一组分。

本发明具有如下优点：

1、从雪旺细胞提取一种新的神经营养蛋白，其分子量为50KD-58KD，不同于目前国外已经从其它组织中提纯的神经营养因子。体内实验证实，该蛋白具对胚龄12～14天大鼠的脊髓前角运动神经元有维持存活的营养作用。体内实验证实能促进损伤后的周围经再生，并发生其生物活性强度与剂量之间存在量效依赖关系。其活性作用不能被神经生长因子抗体阻断。

2、体外试验证明这种雪旺细胞源神经营养因子不仅对脊髓前角运动神经细胞有营养作用，还可以对抗NO的神经细胞的毒性影响，起保护神经细胞作用。

3、体内试验证明这种雪旺细胞源神经营养因子可保护脊髓前角运动神经细胞，不被其周围神经损伤所引起调亡和促进周围神经的再生。

4、本发明用超声粉碎法使雪旺氏细胞粉碎以提取蛋白，由于此思路上的突破和方法学上的创新，极大地提高了蛋白提取量，同时使神经营养蛋白分离的精确度增高，过程简化，节省时间。

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述。

图1为标接记反应混合物的柱层析淋洗曲线图。

图2为标记物免疫活性鉴定曲线图。

图3为温度、时间对配体结合的影响图。

图4为结合饱和曲线图。

图5为Scatchard分析图。

图6为¹²⁵I-SDNF特异结合动力学分析图。

雪旺细胞源神经营养因子(Schwann’s cell Derived Neurotrophic Factor简称SDNF)是从雪旺细胞(Schwann’s cells简称SC)直接分泌出的细胞因子，对脊髓前角运动神经细胞有很强的营养作用和对周围神经再生有很强的促进作用。其详细技术资料，可分下列十四个部分说明：一.雪旺细胞的分离与纯化(一)主要试剂与仪器  1.胰蛋白酶                Sigma                     USA  2.胶原酶(IV)              Sigma                     USA  3.雪旺细胞培养液                                    pH7.3

DMEM/F12培养基          Sigma                     80ml

胎牛血清       杭州四季青生物工程公司             20ml