[发明专利]带有氯霉素抗性的分泌高产戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的菌株

说明书

本发明涉及头孢菌素酰化酶，尤其是关于一种重组戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的重组表达质粒以及该基因在大肠杆菌中的分泌高表达。

7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid，7-ACA)是医药工业合成大多数头孢菌素衍生物的起始原料。7-ACA可以通过发酵产物头孢菌索C(cephalosporin C，CPC)的化学去氨酰化得到。由于化学方法诸如亚胺醚和亚硝酰氯法包括多个造价昂贵的步骤，所以人们一直试图探索用酶法来解决这个问题[Vandamme E J，Voets J P.Adv Appl Micrbiol，1974,17：311]。目前已经发现两类头孢菌素酰化酶(cephalosporin acylase，CA)，分别为戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(glutaryl-7-ACA acylase，GL-7ACA酰化酶)和头孢菌素C酰化酶(cephalosporin C acylase，CPC酰化酶)，它们分别催化GL-7ACA和CPC的水解反应，又因为CPC可以在D-氨基酸氧化酶催化下(D-AAO)很容易生成GL-7ACA[Isogai T et al J Biochem，1990，108：1063]。所以GL-7ACA酰化酶和CPC酰化酶一样，在酶法合成7-ACA上具有重要的应用价值(见图1)。

根据已有的报道，现已有个10头孢菌素酰化酶的基因被克隆[见Matsuda A，Komatsu K I.JBacteriol，1985，163：1222；YangY et al.Chin JBiotech，1991，7：99；Ishii Y et al.JFerment Bioeng，1994，77：591；MatsudaA et al.J Bacteriol，1987，169：5815；Matsuda A et al.J Bacteriol，1987，169：5821；Ishiye M，Niwa M.Biochim Biophys Acta，1992，1132：233；Aramori I et al.，J Ferment Bioeng，1991，72：232；Aramori I et al.JBacteriol，1991，173：7848]。杨蕴刘等从假单胞菌中克隆到GL-7-ACA酰化酶的基因[Yang Y et al.J Bacteriol，1991，7：99]，并测定了其全序列。该酰化酶与GK16酰化酶[Matsuda A.Komatsu K I.J Bacteriol，1985，163：1222]和C430酰化酶[Ishii Y et al.J Ferment Bioeng，1994，77：591]很相似，这三个酶基因具有95％左右的同源性。酶分子量为70千道尔顿，由两个亚基组成，β-亚基分子量为54千道尔顿，α-亚基分子量16千道尔顿；它们最引人注目的特点是在很宽的pH值范围内(pH6.5-9.0)对GL-7ACA都有很高的水解活力；这一点在工业生产上十分有利，因为GL-7ACA水解过程中生成戊二酸，反应液的pH值变化较大。

GK16酰化酶基因最先被一家日本公司克隆[Tsuzuki K et al.NipponNougeikagaku Kaishi，1989，63：1847]。但是该基因只有公开报道的α-亚基的全部序列和β-亚基的部分序列。随后日本另一家公司克隆了C430酰化酶基因，并公开发表了全基因序列[Ishii Y et al.J Ferment Bioeng，1994，77：591]。由于酶基因在假单胞菌中表达量极低，这两家日本公司都对酶基因在大肠杆菌中进行了不同程度的高表达工作，得到的高表达菌株产酶量比原宿主菌(假单胞菌)高出许多倍。杨蕴刘等从假单胞菌克隆的酰化酶基因片段约为3.5kb(kb表示DNA的长度为1000个碱基对)，该基因在假单胞菌中表达极低，即使在大肠杆菌中表达量也很低，粗抽液比活仅为每毫克蛋白0.42单位(0.42unit/mg)[周宏伟等。微生物学报，1997，37：196]，需经复杂的五个步骤才能纯化。李勇等采用基因工程方法改造了此酶基因，改造后的基因在大肠杆菌中得到高表达，菌株产酶量达到每克湿菌2040单位酶，粗抽液酰化酶活力为每毫克蛋白3.5单位，而且粗抽液经过简单的两步层析柱纯化后比活力就已达到每毫克蛋白12单位[YongLi et al.Protein Expressionand Purification，1998，12：233-238]。