[发明专利]L－亮氨酸的生产方法及有关DNA和微生物

说明书

发明背景

本发明涉及编码突变α—异丙基苹果酸合酶的DNA。本发明也涉及具有突变α—异丙基苹果酸合酶的产L—亮氨酸微生物，以及利用这种微生物生产L—亮氨酸的方法。L—亮氨酸是一种必需氨基酸，可以用作食品或饲料营养添加剂，医学处置、药物或化学工业用试剂或材料，或用于生产赖氨酸等其他氨基酸的生长因子。

在过去，L—亮氨酸主要利用属于短杆菌属、棒杆菌属或沙雷氏菌属、产生L—亮氨酸的微生物或其突变体通过发酵方法生产(氨基酸发酵，日本科学学会出版社，pp 397—422，1986)。

使用黄色短杆菌VKPM B—2736时获得最高水平的L—亮氨酸积累。这种菌株在试验发酵罐中发酵72小时后在含蔗糖培养基中积累的L—亮氨酸浓度达26 g／L(USSR作者证书1394711)。乳发酵短杆菌34在含蔗糖培养基中产生高达34 g／L的L—亮氨酸(Appl．Environ．Microbiol．，51，p．1024(1986))。

如上所述，L—亮氨酸生成能力已被提高到一定程度，但是，仍需要开发更有效和经济的方法，以便满足未来对L—亮氨酸的日益增长的需求。

另一方面，属于埃希氏菌属的微生物由于其快速生长能力、由遗传分析获得的突出的数据和充足的遗传材料有可能被用作高效的L—亮氨酸产生菌。但是，有关使用属于埃希氏菌属的细菌生产L—亮氨酸的报导还很少。

关于埃希氏菌属的L—亮氨酸产生菌株，已知有抗β—噻吩丙氨酸的菌株，抗β—噻吩丙氨酸和β—羟基亮氨酸的菌株(日本专利公告号62—34397(1987))和抗4—氮亮氨酸或5，5，5—三氟亮氨酸的菌株(日本专利中请公开号8—70879(1996))。

但是，还未发现抗L—亮氨酸的埃希氏菌属细菌，也未发现L—亮氨酸抗性和L—亮氨酸生成能力的关系。

发明概述

本发明基于前述观点完成，目的之一是提高埃希氏菌属细菌的L—亮氨酸生成能力，提供有效和经济的生产L—亮氨酸的方法。

为了实现上述目的发明人进行了大量研究，结果发现α—异丙基苹果酸合酶(以下称为IPMS)的L—亮氨酸反馈抑制脱敏作用有助于提高L—亮氨酸生成能力，至此完成了本发明。

即，本发明提供了编码以下(A)或(B)的蛋白的DNA(以下也称为本发明的DNA)：

(A)具有序列2所示氨基酸序列的蛋白，其中具有选自以下(a)到(e)的置换：

(a)482位另一种氨基酸残基置换苏氨酸残基，

(b)386位另一种氨基酸残基置换谷氨酸残基，

(c)428位另一种氨基酸残基置换脯氨酸残基，

(d)479位另一种氨基酸残基置换甘氨酸残基，以及

(e)462位另一种氨基酸残基置换甘氨酸残基，

(B)具有蛋白(A)氨基酸序列的蛋白，其序列中有一个或几个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加，所述蛋白(B)具有α—异丙基苹果酸合酶活性，L—亮氨酸对该活性的反馈抑制被脱敏至与蛋白(A)相同。

优选本发明的DNA中置换选自以下(a’)到(e’)：

(a’)482位异亮氨酸残基置换苏氨酸残基，

(b’)386位赖氨酸残基置换谷氨酸残基，

(c’)428位亮氨酸残基置换脯氨酸残基，

(d’)479位半胱氨酸残基置换甘氨酸残基，以及

(e’)462位天冬氨酸残基置换甘氨酸残基。

本发明DNA的具体实施例包括具有序列1所示核苷酸序列的DNA，其中具有选自以下(ⅰ)到(ⅴ)的突变：

(ⅰ)1445位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，

(ⅱ)1156位鸟嘌呤突变为腺嘌呤，

(ⅲ)1283位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，

(ⅳ)1435位鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，以及

(ⅴ)1385位鸟嘌呤突变为腺嘌呤。

本发明还提供用本发明的DNA转化具有L—亮氨酸生成能力的微生物(以下也称为“本发明的微生物”)。优选本发明的微生物属于埃希氏菌属。更优选本发明的微生物是大肠杆菌。

本发明还提供生产L—亮氨酸的方法，包括以下步骤：

在培养基中培养本发明的微生物以在培养基中产生和积累L—亮氨酸，并且

由培养基中回收L—亮氨酸。

发明详述

以下详述本发明。

1．本发明的DNA

本发明的DNA在编码野生型IPMS的DNA中具有一种突变，使该DNA编码的IPMS的L—亮氨酸反馈抑制被脱敏。