[发明专利]一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法

权利要求书

1、一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其过程包括PCR，其特征在于所述的步骤包括：

1)从苏云金芽胞杆菌以色列亚种中克隆出p19、p20两个与野生型菌株的基因型一致的辅助蛋白基因；

2)将辅助基因进行限制性内切酶酶切，并连接到适当的载体上，使辅助基因能够在苏云金芽胞杆菌中正常表达；

3)将含p19、p20的穿梭质粒分别电转化入野生型菌株；

4)通过质粒图谱、PCR、DNA-DNA杂交和聚丙烯酰氨凝胶电泳筛选、鉴定转化子；

5)通过摇瓶培养、生物测定筛选发酵性能优良、毒力高的转化子。

1、根据权利要求1所述的一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其特征在于步骤3)所述的方法包括：

以272mM蔗糖，15％甘油配制的溶液作为缓冲液，在0.4cm电脉冲杯中置50-80μl感受态细胞，加入质粒5μl，采在25μF，200Ω，6.25-9KV/cm的电脉冲条件下电击一次。

3、根据权利要求1所述的一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其特征在于步骤4)所述的方法包括：

以1％D蛋白栋，0.5％酵母粉，1％NaCl，pH7.的培养液过夜培养活化菌种，再用活化菌液接种(1/100)LB培养液。待菌体生长至对数中期，收集菌体，TE(10mM Tris·Cl，1mMEDTA，pH8.0)洗菌一次，菌体悬于100μl溶液I(50mMGlucose，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA)，加入5-10μl溶菌酶(20mg/ml)，以后的操作按碱法质粒抽提进行。

4、根据权利要求4所述的一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其特征在于该步骤中的PCR的条件是：94℃1分钟，49℃1分钟，72℃1分钟，25个循环。

6、根据权利要求1所述的种苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤5)中的生物测定采用的培养基配方为：黄豆饼粉4、玉米淀粉2％，鱼粉1％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.2、KH₂PO₄0.1、MgSO₄·7H₂O0.07％，CaCO₃0.2％。

7、根据权利要求1所述的一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其特征在于所述的步骤5)中的发酵培养基配方为：碳源5.0％、氮源A4.0％、氮源B2.0％、氮源C0.2％、生长因子0.1％、KH₂PO₄ 0.2％、CaCO₃0.2％。