[发明专利]溶血栓药物重组葡激酶

说明书

本发明是一种溶血栓药物重组葡激酶，属于生物医学领域的DNA基因工程，涉及一种用于溶解血栓的药物重组葡激酶(Sak)基因及其高表达工程菌株，该表达产物对血纤维蛋白具有很高的降解活性。

葡激酶(staphylokinase Sak)是90年代诞生的一种新型生物技术治疗药物，是金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外蛋白质，它类似尿激酶(Uk)和链激酶(Sk)，具有溶血栓的特性。目前，临床上治疗血栓的药物主要使用的是尿激酶、链激酶等，存在对血栓的溶解速度慢，溶栓效果差，对构成血栓骨架的血纤维蛋白专一性差，易造成血液系统中正常纤维蛋白原也被降解，从而激活系统纤溶作用引起出血的缺点。德国文献M.G.G(1987,210,P258)和中国专利95111222 94112105 97105988 9810213297103921分别报道了第34位核苷酸序列及其对应氨基酸为GGT Gly的葡激酶(Sak)。文献“Nucleic Acid Research”(1983,11(22)P679)介绍了第11位和第34位核苷酸序列及其对应氨基酸分别为AAG Lys和GGT Gly的葡激酶(Sak)。比利时文献Fibrinolysis(1992,6,P226)报道了第11位核苷酸序列及其对应氨基酸为AAG Lys的葡激酶(Sak)。据“国外医学临床生物化学与检验学分册”(1998年第19第4期156-158)报道了Sako等从金黄色葡萄球菌SΦ-C基因克隆了Sak基因并确定了其序列，构建了PMEX-602Sak重组质粒，在tac启动子和两个串连的SD序列控制下，在大肠杆菌中获得高效表达，表达量占菌体的总蛋白10％-15％。“生物工程”1994年12卷2期文章“治疗血栓用药重组葡激酶的高产率生产和纯化”介绍了用发酵罐培养转染大肠杆菌TG1细胞产生葡激酶，其表达量占菌体总蛋白的10％-15％，是不适于工业化生产治疗血栓病的葡激酶。

本发明的目的就是找到一种新葡激酶基因序列，构建新的葡激酶基因高表达工程菌株，提高葡激酶基因的表达水平，用于生产人体血栓病治疗的溶血栓药物重组葡激酶。它具有特异地、有选择地、专一地溶解血纤维蛋白凝块作用，能减少出血的副作用，安全有效地溶血栓。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

首先筛选出一种葡激酶基因，该基因是由金黄色葡萄球菌的溶原性转换噬菌体α的DNA，经PCR扩增获得的，该基因的核苷酸全序列及其编码的氨基酸如下序列：TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAA TAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTSer Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GATTyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val AspAGT AAA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTSer Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GATGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu AspGCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCAla Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys IleGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCTGlu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe ProATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTIle Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn ProGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA TAAGly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys End