[发明专利]热耐受性肌醇六磷酸酶

说明书

肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酯磷酸水解酶；EC 3.1.3.8)是一种将肌酸六磷酯水解成肌醇和无机磷酸的酶，并且已知是有价值的饲料添加剂。

1907年首次描述了稻糠中的肌醇六磷酸酶[Suzuki et al.，Bull.Coll.Agr.Tokio Imp.Univ.I，495(1907)]，并在1911年描述了从曲霉得到的肌醇六磷酸酶[Dox and Golden，J.Biol.Chem.10，183-186(1911)]。还在麦麸、植物种子、动物小肠和微生物中发现了肌醇六磷酸酶[Mowsen and Davis，Enzyme Microb.Technol.5，377-382(1983)，Lambrechts et al.，Niotech.Lett.14，61-66(1992)，Shine and Ware，Appl.Microbiol.16，1348-1351(1968)]。

Van Hartingsveldt等人在Gene，127，87-94(1993)和欧洲专利申请No.420 358中描述了得自黑曲霉的肌醇六磷酸酶的克隆和表达，并且Piddington等人在Gene，133，55-62(1993)中描述了得自黑曲霉变种(var awamori)之肌醇六磷酸酶的克隆和表达。

因为迄今用于农业中的肌醇六磷酸酶有某些缺点，所以本发明

因为迄今用于农业中的肌醇六磷酸酶有某些缺点，所以本发明的目的是提供新的肌醇六磷酸酶，或者更一般地说是大量提供具有改良属性的包括肌醇六磷酸酶在内之抗肌醇磷酸酯(肌醇六磷酸酶活性)的肌醇六磷酸酶活性的多肽。因为已知迄今使用的肌醇六磷酸酶在饲料成粒加工期间受到热处理会失去活性，所以本发明的肌醇六磷酸酶应有改善热耐受性的性质。

除烟曲霉(Aspergillus fumigatus)[Dox and Golden et al.，J.Biol.Chem.10，183-186(1911)]和米根霉(Rhizopus oryzae)[Howsonand Davies，Enzyme Microb.Technol.5，377-382(1993)]外，迄今尚未报导过耐热真菌中的肌醇六磷酸酶。已报导了来源于土曲霉(Aspergillus terreus)菌株9A-1[最适温度70℃；Yamada et al.，Agr.Biol.Chem.，32，1275-1282(1968)]和卡斯坦氏许日王氏酵母(Schwanniomyces castellii)[最适温度77℃；Segueilha et al.，Bioeng.74，7-11(1992)]的耐热肌醇六磷酸酶。但这些用于农业时，必须大量得到之。因此，本发明的目的是提供编码热耐受性肌醇六磷酸酶的DNA序列。可用本领域已知的检测法，如用于饲料造粒的方法或例如由Yamada等人(文献同上)描述的检测酶促活性的热依赖性的方法，检测由这些DNA序列编码的改良的肌醇六磷酸酶的热耐受性。

本发明的再一个目的是筛选用于肌醇六磷酸酶生产时显示有某种程度热耐受性的真菌。可按实施例1中所述方法进行这种筛选。以这种方法，已第一次鉴定了实施例1中所列的生产肌醇六磷酸酶的热耐受性真菌菌株。

可按本领域已知的方法，例如用热耐受性真菌(参见实施例1)菌株提供者，如American Tissue Type Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)和Cen-tralbureau voor Schimmelcultures(CBS)等所指定的方法，或者，如实施例2中指出的方法培养这样的菌株。

进一步的改良的性质是例如改善了对植物和种子中的磷的主要储存形式的肌醇六磷酸[肌醇(1，2，3，4，5，6)六磷酸]底物特异性。为了从肌醇六磷酸中完全释放出六个磷酸基团，需要有足够活性的针对肌醇六磷酸和所有其它肌醇磷酸酯分子的酶。为了这种完全释放，需要使用例如黑曲霉肌醇六磷酸酶，加上pH2.5酸性磷酸酶。只有一种具所需活性的酶显然是一个进步。例如，国际专利申请No.94/03072中公开了以所需比例表达肌醇六磷酸酯降解酶之混合物的表达系统。然而，更期望在单一多肽中具有两种上述活性。因此本发明的目的还包括提供编码这种多肽的DNA序列。可用本领域已知的或实施例9中描述的方法检测肌醇六磷酸酶和磷酸酶。