本发明提供一种双基因敲除载体系统，所述载体系统包括CD163基因敲除载体和CD13基因敲除载体，其中：所述CD163基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3任一项所示；所述CD13基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4‑6任一项所示；所述CD163基因敲除载体与所述CD13基因敲除载体的载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2。通过上述载体系统可以简单、快速、高效地定点同时敲除CD163基因和CD13基因。
本发明涉及基因工程，并且可以在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法药用产品。对各种基因组编辑方法的实现提出了基于VTvaf1V基因疗法DNA载体的基因疗法载体，即携带靶Cas9基因的载体，用于在人和动物细胞中该靶基因的异源表达。基因疗法DNA载体VTvaf17‑Cas9具有核苷酸序列SEQ ID No.1。携带Cas9靶基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf1V的基因疗法DNA载体，所述DNA载体由于如下实情是独特的：由于VTvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小，构建的基因疗法DNA载体VTvaf17还提出了生产特定载体的方法、使用载体的方法、携带特定载体的大肠杆菌菌株以及工业规模上生产特定载体的方法。
本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种载体系统、制备猪成纤维细胞和基因编辑猪的方法。所述载体系统包括CD163基因敲除载体和MSTN基因敲除载体，所述CD163基因敲除载体包括载体骨架以及连接到该载体骨架上的核苷酸序列SEQ ID NO：1；所述MSTN基因敲除载体包括载体骨架以及连接到该载体骨架上的核苷酸序列本发明载体系统和方法具有降低基因操作难度、提高敲除效率，在短时间内快速将CD163基因和MSTN基因敲除的优点。本发明方案无需药物筛选，不带有外源筛选标记，具有较为简便的细胞筛选流程。可以一次性获得双基因缺失的细胞系，大大缩短了双/多基因编辑动物的制备流程。
