[发明专利]一种高纯度的PBMC分离方法

摘要

本发明提供了一种高纯度的PBMC分离方法，包括以下步骤：将采集的全血离心10min；吸取上层的血浆离心30min；使用PBS将离心后的血样沉淀悬浮；在离心管中加入Lymphoprep，然后离心30min；将离心后的血样弃去上层PBS，将白膜层收集到一个新离心管内，每管约装20‑25ml；补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，取混匀的溶液离心5min，弃去上清；用含有2％自体血清的PBS重悬细胞至50ml，混匀并计数；弃去上清的溶液加合适体积的淋巴细胞冻存液重悬细胞。本发明使得分离出来的PBMC红细胞含量更少，品质更佳，更有利于下游实验的进行。

主权项

1.一种高纯度的PBMC分离方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、从志愿者体内采集全血，将得到的血样1000g离心10min；步骤2、吸取上层的血浆转移到一个干净的离心管里，抽取1500g离心30min；步骤3、使用PBS将步骤2中离心后的血样沉淀悬浮；步骤4、在50ml离心管中加入25ml Lymphoprep，然后将步骤3中的血样加到Lymphoprep上层，保证血样与Lymphoprep之间有约1cm左右的混合层，血样体积不要超过15ml；步骤5、使用水平转子，取650g步骤4中加入Lymphoprep后的血样离心30min，温度19℃，升速设置5(慢速)，降速设置0；步骤6、将步骤5中离心后的血样弃去上层PBS，将白膜层收集到一个新的50ml离心管内，每管约装20‑25ml；步骤7、将步骤6中每管约装20‑25ml的白膜层补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；步骤8、将步骤7中弃去上清的溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20‑25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；步骤9、将步骤8中弃去上清的溶液用含有2％自体血清的PBS重悬细胞至50ml，混匀并计数；步骤10、根据需要新鲜PBMC的数量，取相应体积的步骤9中的悬液转移至提前准备好的50ml离心管中并用保存液补充至50ml，放置在4℃冰箱；步骤11、将步骤10中剩下的细胞溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20‑25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；步骤12、将步骤11中弃去上清的溶液加合适体积的淋巴细胞冻存液重悬细胞，按照不同规格分装至冻存管，1mL/管，每支冻存细胞按照冻存规格的1.3倍冻存；步骤13、将分装好的细胞贴上标签(需要注明信息：批号，细胞密度，体积，储存条件等)；步骤14、将细胞放至细胞程序降温盒里，立即冻存于‑80℃冰箱；步骤15、隔天将细胞转移至液氮罐中，做好细胞库信息登记以方便取用。