[发明专利]一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法

摘要

本发明公开了一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，包括以下步骤：S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数约为80‑200万/mL；S2、奶牛血清和乳清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清。本发明通过制定全新的奶牛乳腺炎治疗策略，通过分离奶牛的血清和乳清检测了烟酸治疗后乳腺炎奶牛体内促炎介质的表达，利用分子生物学方法全面的评估了烟酸对奶牛乳腺炎的治疗效果，烟酸能够有效减少奶牛血清和乳清中促炎介质的表达，从而达到保护乳腺缓解炎症的功效。

主权项

1.一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数约为80‑200万/mL；S2、奶牛血清和乳清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清；S3、奶牛乳汁中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛患病乳房或正常乳房中的乳汁，然后提取乳汁中的乳清；S4、CCK8实验将原代奶牛乳腺上皮细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔含有细胞约0.5×10⁴个，加入培养基100μL，将细胞放入37℃和5％CO₂的无菌恒温培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度的烟酸或烟酸+LPS，待24小时后再次向每个孔中加入10μL的CCK8试剂，继续在培养基中培养2小时，然后取出96孔板放入酶标仪中在450nm波长处测定吸光光度；S5、烟酸对原代奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的抑制作用试验将0.3×10⁵个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分为4组：正常组、烟酸组、LPS(1μg/ml)组、LPS+烟酸组，当细胞数达到培养皿的80％时，用无血清培养基代替培养基培养3小时后加入烟酸，再过1小时后加入LPS，3小时后收集培养皿中的原代奶牛乳腺上皮细胞，收集好的细胞用Trizol法提取总RNA并反转录成cDNA用于后续试验或者提取细胞中的总蛋白并应用BCA蛋白浓度测定法将细胞中的总蛋白含量统一用于后续试验，在后续试验中利用荧光定量PCR法检测原代乳腺上皮细胞中IL‑6、TNF‑α和IL‑1β的基因表达，再利用western blot法检测原代奶牛乳腺上皮细胞中COX2和INOS的蛋白表达；S6、烟酸对GPR109A的激活作用将0.3×10⁵个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分别用烟酸处理0h、1h、3h、6h和12h后收集细胞并提取细胞中的总蛋白，通过western blot的方法检测细胞中GPR109A的表达量。