[发明专利]以腐草霉素为筛选标记/GFP作报告基因的米曲霉转基因体系构建方法

摘要

以腐草霉素为筛选标记/GFP作报告基因的米曲霉转基因体系构建方法，首先对编码腐草霉素抗性基因乙酰转移酶blmB进行密码子优化，以gpdA为基因表达的启动子、trpc为终止子构建blmB基因表达盒，再将pEX1载体改造为携带blmB基因完整表达核和荧光报告基因GFP的双元重组载体blmB‑pEX1，依次将重组载体blmB‑pEX1转化GV3101农杆菌感受态细胞，再对米曲霉孢子和农杆菌的菌液共培养，进行农杆菌介导的米曲霉转基因，共培养后通过腐草霉素抗性筛选培养基筛选，最后挑抗性转化子扩大培养，由荧光显微镜观察GFP成功表达，有效降低转化子假阳性率，减少筛选工作量，以克服抗性筛选标记不足问题。

主权项

1.以腐草霉素为筛选标记/GFP作报告基因的米曲霉转基因体系构建方法，其特征在于，具体步骤如下：1)构建blmB基因表达盒①对编码腐草霉素抗性基因乙酰转移酶blmB进行密码子优化，并对优化后的编码腐草霉素抗性基因乙酰转移酶blmB进行人工合成blmB基因序列，序列为SEQ ID NO:1所示；同时以序列SEQ ID NO:1的DNA片段为基础设置一号特异引物进行PCR扩增，克隆blmB基因的全长，得blmB基因PCR产物，而后将blmB基因PCR产物片段亚克隆至pGM‑T载体上；②利用酶切位点Xho I和BamH I将pGreen2载体双酶切后，与同样双酶切后的blmB基因片段采用T4 DNA连接酶进行连接，形成以gpdA为基因表达的启动子、trpc为终止子的blmB基因表达盒，再对blmB基因表达盒使用二号特异引物进行扩增完整blmB基因表达盒；2)blmB‑pEX1重组质粒的构建与农杆菌转化利用酶切位点Xho I和BamH I将pEX1载体双酶切，通过T4 DNA Ligase将双酶切后的pEX1载体与步骤1)中得到的blmB基因表达盒相连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，以构建blmB‑pEX1重组质粒；3)重组质粒转化农杆菌将步骤2)中所得的blmB‑pEX1重组质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞；4)制备米曲霉3.042株系孢子将米曲霉3.042株系的孢子接种于PDA固体培养基活化，3天后采用无菌水洗涤收集孢子悬浮液，而后将孢子悬浮液过滤后5000rpm离心富集，再采用无菌水对孢子洗涤2次，最后通过血细胞计数板在显微镜下计数，加无菌水将孢子浓度调整到10⁷个/ml，得米曲霉孢子悬浮液；5)制备农杆菌菌液将步骤3)中所得含有blmB‑pEX1重组质粒的农杆菌菌液接种于10ml的LB液体培养基，LB液体培养基中含100μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平，在28℃温度条件下200rpm过夜摇菌；再吸取1ml本步骤前述的LB液体培养液加9ml的IM液体培养基混合后置于28℃温度条件下200rpm摇菌6h至OD₆₀₀为0.7，得农杆菌菌液；6)农杆菌与米曲霉共培养取80μl的农杆菌菌液和80μl米曲霉孢子悬浮液，混合均匀后涂布至IM固体培养基，在22℃温度条件下避光培养；暗培养60h后，将CD固体培养基冷却至不烫手后倒在本步骤的IM固体培养基上均匀覆盖，此处CD固体培养基冷却至不烫手的温度为50℃～55℃，此温度下加入抗生素不会失效；30℃温度条件下避光培养5‑7天，长出的菌落即为抗性转化子；7)抗性转化子筛选及鉴定挑取步骤6)中获得的抗性转化子接种至铺有载玻片的CD固体培养基上扩大培养，再收集菌丝，而后使用天根生物公司的基因组DNA提取试剂盒提取米曲霉菌丝基因组DNA，依次使用四号特异引物对米曲霉菌丝基因组DNA进行PCR扩增验证，进一步通过DNA测序后验证插入片段是否正确，最后通过荧光显微镜观察GFP的荧光成像，以直观地检测转入的外源基因表达状态。