[发明专利]一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法有效
| 申请号： | 201910357429.9 | 申请日： | 2019-04-29 |
| 公开（公告）号： | CN110106197B | 公开（公告）日： | 2023-06-13 |
| 发明（设计）人： | 余方伟;王神云;李建斌;张伟;唐君;王红;于利 | 申请（专利权）人： | 江苏省农业科学院 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N15/31 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 210014 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，包括预测芸薹根肿菌分泌蛋白的信号肽序列；构建芸薹根肿菌分泌蛋白载体：提取感染根肿病的拟南芥根部RNA，反转录成cDNA，作为PCR扩增模板，利用高保真酶KOD‑FX NEO扩增预测信号肽序列；构建pSUC2‑PbCe1；酵母转化；酵母转化子的PCR验证。本发明提供的芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，可以为芸薹根肿菌的分泌蛋白鉴定以及相关的后续研究提供强有力的技术支持。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 芸薹根肿菌 分泌 蛋白 鉴定 方法 | ||
【主权项】：
1.一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)预测芸薹根肿菌分泌蛋白的信号肽序列；(2)构建芸薹根肿菌分泌蛋白载体：提取感染根肿病的拟南芥根部RNA，反转录成cDNA，作为PCR扩增模板，利用高保真酶KOD‑FX NEO扩增预测信号肽序列；(3)将扩增产物进行电泳，回收目的片段，连接pMD18‑T，构建pMD18‑T‑PbCe1，并转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的阳性克隆提取质粒，酶切回收；将回收片段与经同一组酶消化的pSUC2连接，构建pSUC2‑PbCe1，转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的阳性克隆提取质粒备用；(4)酵母转化：将步骤(3)测序正确的质粒pSUC2‑PbCe1转化酵母菌YTK12，采用LiAc转化法转化酵母，涂布于SD‑Trp板，30℃倒置培养3‑5天；(5)酵母转化子的PCR验证：提取酵母转化子的质粒，并利用PCR验证阳性克隆；(6)将步骤(5)所述的阳性克隆利用一缺营养液SD‑Trp摇培过夜，次日离心收集菌体，并用灭菌水重悬，再次离心收集菌体，利用平板生长实验和TTC实验进行验证。
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