[发明专利]一种黑色素细胞液的制备方法及其应用

摘要

本发明提供一种黑色素细胞液的制备方法及其应用，所述黑色素细胞液的制备方法包括以下步骤：S1、取黑色素疱壁用无菌PBS清洗，再放入胰蛋白酶中，保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，离心，弃去上清液，留取沉淀物；S2、向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度，接种于培养瓶中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素，当细胞达到80％～90％融合后，用胰蛋白酶‑EDTA对黑素细胞进行消化传代，即得黑色素细胞液。本发明提出的制备方法，操作简单，黑色素细胞的存活率高、增殖速度快，制备得到的黑色素细胞液能应用于自体黑色素细胞移植中。

主权项

1.一种黑色素细胞液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗2～3次，再放入浓度为0.05％～0.25％的胰蛋白酶中，于2～5℃保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在1000～3000r/min的转速下离心5～10min，弃去上清液，留取沉淀物；S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为3～6×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素80～150ug/ml，1～3天换液一次，当细胞达到80％～90％融合后，用浓度为0.02％～0.1％的胰蛋白酶‑EDTA对黑素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：7％～15％的血清、0.5％～2％的青霉素‑链霉素混合溶液、余量的Ham F10细胞培养基，且黑色素细胞完全培养基中还包括成纤维细胞生长因子15～30ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂10～30ug/ml、佛波酯40～60ng/ml、聚乙二醇200 20～40ng/ml、内皮素20～40ng/ml、海藻糖15～25g/ml、霍乱毒素10～20ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.05～0.2mmol/L、原钒酸钠0.5～2umol/L；所述青霉素‑链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。