[发明专利]一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法在审
| 申请号： | 201811479409.0 | 申请日： | 2018-12-05 |
| 公开（公告）号： | CN109576341A | 公开（公告）日： | 2019-04-05 |
| 发明（设计）人： | 王蓉;谭围;陈傅晓;冯全英;樊佳伟;王荣霞;柯宏基 | 申请（专利权）人： | 海南省海洋与渔业科学院(海南省海洋开发规划设计研究院) |
| 主分类号： | C12Q1/18 | 分类号： | C12Q1/18;C12Q1/04;G01N30/02;G01N30/72;G01N30/74;C12R1/63 |
| 代理公司： | 重庆市信立达专利代理事务所(普通合伙) 50230 | 代理人： | 包晓静 |
| 地址： | 570100 海*** | 国省代码： | 海南;46 |
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| 摘要： | 本发明属于药物筛选领域，公开了一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法，所述抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法为：采用紫海胆的放线菌利用分菌技术进行分离，利用培养技术和萃取技术得发酵液浸膏，通过活性筛选和结构新颖性筛选有价值的放线菌，对放线菌进行小规模发酵、提取浸膏，对提取的化合物进行分离，并进行结构鉴定，活性确认。本发明首次对海南南海紫海胆肠道放线菌的活性次级代谢产物进行检测与筛选，首次利用海洋生物肠道放线菌发酵产物筛选抗石斑鱼病原弧菌活性的活性分子，从中筛选出抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物。 | ||
| 搜索关键词： | 病原弧菌 放线菌 石斑鱼 筛选 药物先导化合物 紫海胆 肠道 次级代谢产物 发酵产物 活性分子 活性筛选 结构鉴定 药物筛选 萃取技术 发酵液 新颖性 海洋生物 发酵 检测 | ||
【主权项】：
1.一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法，其特征在于，所述抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法为：步骤一：将采用无菌陈海水冲，75％酒精消毒及用无菌水洗3遍后的紫海胆，取其肠道组织置于无菌水中，稀释，吸取200μL，涂在含有50μg/mL重铬酸钾和20μg/mL卡那霉素的高氏培养基平板上，在28℃下培养15天，挑取单菌落划线接种至ISP2培养基平板上，经3次单菌落划线纯化即得到放线菌菌株；步骤二：利用液体高氏培养基和麦芽提取物培养基小规模发酵所纯化的放线菌，过滤发酵液得到菌液和菌体，将菌液浓缩后用乙酸乙酯提取，菌体用氯仿甲醇，体积比为1:1浸提，浓缩后得到的提取物供抗病原菌活性筛选；步骤三：采用平板滤纸片法筛选出2株菌株发酵液的乙酸乙酯粗提物对石斑鱼溶藻弧菌菌株具有生长抑制活性，抑菌圈直径为8–17mm；步骤四：利用上述培养基并通过优化培养条件和添加诱导物小规模发酵上述2株活性菌株，过滤除去菌体，用乙酸乙酯萃取发酵液，得粗提物，并进行活性筛选，并对诱导后的菌株产生的新次级代谢产物进行检测；步骤五：分别利用筛选培养基和添加诱导物的培养基对2株放线菌在优化好的培养条件下进行大规模发酵，发酵液与菌丝体分别以乙酸乙酯、等体积的氯仿甲醇萃取3遍，然后在抗菌活性筛选指导下，采用多种色谱分离技术将活性成分从发酵液和菌体粗提物中分离精制出来；步骤六：综合运用现代波谱技术确定单体化合物的化学结构及空间立体化学结构；步骤七：用平板滤纸片法对上述结构确定的活性化合物进行抗石斑鱼病原弧菌活性评价，排除假阳性可能和其他干扰，以得到真正的抗菌、抗病新活性物质；步骤八：对以上活性确定的化合物，采用化学或生物合成的方法进行结构修饰、制备系列衍生物，再进行活性评价，确定其构效关系，筛选出活性更强、毒性更低的防治石斑鱼弧菌病害药物的生物源天然药物先导化合物。
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- 本发明涉及一种抗菌不锈钢抗真菌性能检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；美蓝染色后菌悬液活菌含量CB血球板计数及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标曲建立；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的不锈钢抗真菌性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养24h/48h后对照样品和抗菌样品，测定回收液IB并以lgIB表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的抗菌不锈钢抗真菌性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标曲法，将以先进检测技术支撑产品质量提升。
- ATP生物荧光lgCB-lgIB标曲法检测抗菌陶瓷抗细菌性能的方法-201910199712.3
- 李文杰;郝凌云;刘晓慧;郭凤柳;崔宗岩 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种抗菌陶瓷抗细菌性能的检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；OD值‑活菌含量对数值lgCB标曲建立及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标曲建立；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的陶瓷抗细菌性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养24h后对照样品和抗菌样品，测定回收液IB并以lgIB表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的陶瓷抗细菌性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标曲法，将以先进检测技术支撑产品质量提升和市场秩序规范。
- ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测抗菌塑料防霉性能的方法-201910199713.8
- 李文杰;张小东;冯金艳;艾连峰;郝凌云 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种抗菌塑料防霉性能的检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；OD值‑活菌含量对数值lgCB标曲建立及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的塑料防霉性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养48h后的对照样品和抗菌样品，测定回收液IB并以lgIB表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的抗菌塑料防霉性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标准曲线法，将以科学先进的检测技术支撑产品质量提升。
- ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测抗菌皮革防霉性能的方法-201910199714.2
- 李文杰;靳慧达;连素梅;洪伟;崔宗岩 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种抗菌皮革防霉性能检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；OD值‑活菌含量对数值lgCB标曲建立及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的皮革防霉性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养48h后的对照样品和抗菌样品，测定回收液IB并以lgIB表征和计算R或A；同时提供结果评价依据。本发明研发的抗菌皮革防霉性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标准曲线法，将以科学先进的检测技术支撑产品质量提升。
- ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法检测抗菌陶瓷抗真菌性能的方法-201910199715.7
- 李文杰;刘晓慧;郭凤柳;洪伟;郝凌云 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种抗菌陶瓷抗真菌性能检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；美蓝染色后菌悬液活菌含量CB血球板计数；ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标曲建立及接种菌液活菌CA标定；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IA测定及活菌ATP浓度CA和TA推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的陶瓷抗真菌性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养24h/48h后对照样品和抗菌样品，测定其IA并以lgIA表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的陶瓷抗真菌性检测的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标曲法，将以先进检测技术支撑产品质量提升。
- ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测抗菌橡胶防霉性能的方法-201910199716.1
- 李文杰;周波;贺鹏;孟祥振;郝凌云 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种抗菌橡胶防霉性能的检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；OD值‑活菌含量对数值lgCB标曲建立及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的橡胶防霉性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养48h后的对照样品和抗菌样品，测定回收液IB并以lgIB表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的抗菌橡胶防霉性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标准曲线法，将以科学先进的检测技术支撑产品质量提升。
- ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法检测抗菌塑料抗细菌性能的方法-201910199717.6
- 李文杰;刘晓慧;杨宇龙;郭凤柳;曹彦强 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种抗菌塑料抗细菌性能检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标曲建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IA测定及其活菌ATP浓度CA和TA推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的塑料抗细菌性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养24h后的对照样品和抗菌样品，测定回收液IA并以lgIA表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的抗菌塑料抗细菌性能检测的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标曲法，将以先进的检测技术支撑产品质量提升和市场秩序规范。
- ATP荧光lgCA-lgIA标曲法评价一次性卫生用品真菌杀灭效果的方法-201910199718.0
- 李文杰;靳慧达;娄巧哲;连素梅;崔宗岩 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种一次性卫生用品真菌杀灭效果评价方法，检测步骤包括：样品提取等要求；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；美蓝染色后菌悬液活菌含量CB血球板计数；ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标曲建立及接种菌液活菌CA标定；中和剂鉴定及杀菌试验；回收液IA测定及CA推算；杀菌率R和灭菌指数A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的卫生用品真菌杀灭效果进行精准定量评价。本发明规定洗脱回收染菌不同时间后的对照样品和试验样品，测定回收液IA并以lgIA表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的一次性卫生用品真菌杀灭效果评价的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标曲法，可完善相关评价方法体系。
- ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测家用电器抗细菌性能的方法-201910199720.8
- 李文杰;艾连峰;钱云开;郝凌云;郭凤柳 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种家用电器抗细菌性能检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；OD值‑活菌含量对数值lgCB标曲建立及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标曲建立；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的家电抗细菌性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养24h后对照样品和抗菌样品，测定回收液IB并以lgIB表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的家用电器抗细菌性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标准曲线法，将以科学先进的检测技术支撑产品质量提升。
- ATP生物荧光lgCA-lgIA标曲法评价液体消毒剂细菌杀灭效果的方法-201910199722.7
- 李文杰;崔宗岩;钱云开;闫冀焕;慈颖;宿雅彬 - 李文杰
- 2019-03-15 - 2019-09-24 - C12Q1/18
- 本发明涉及一种液体消毒剂细菌繁殖体杀灭效果评价方法，检测步骤包括：样品提取及最低有效浓度确定；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标曲建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定；中和剂鉴定及定量悬液试验；回收液IA测定及其活菌ATP浓度CA和TA推算；杀灭率R及灭菌指数A计算；结果判定；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的消毒剂细菌繁殖体杀灭效果进行精准定量评价。本发明规定回收作用不同时间后的试验样液和对照样液，测定其IA并以lgIA表征和计算R或A；提供结果判定依据。本发明研发的消毒剂细菌繁殖体杀灭效果评价的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标曲法，可完善消毒效果评价方法体系。
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