[发明专利]一种Klenow（exo-）突变蛋白的表达纯化方法

摘要

本发明公开了一种Klenow(exo‑)突变蛋白的表达纯化方法，具体步骤如下：扩增Klenow(exo‑)目的片段；构建重组表达质粒pTrc99a‑klenow(exo‑)；重组表达质粒的诱导表达；Klenow(exo‑)蛋白的初步纯化；Klenow(exo‑)蛋白的进一步纯化。本发明公开提供了一种大规模制备klenow(exo‑)蛋白的方法，通过overlap获得klenow(exo‑)基因并引入组氨酸标签，利用大肠杆菌表达系统获得高纯度的klenow(exo‑)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低。

主权项

1.一种Klenow(exo‑)突变蛋白的表达纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)扩增Klenow(exo‑)目的片段①以大肠杆菌BL21基因组为模板，分别用引物F1、R1和F2、R2进行PCR扩增，获得片段1和片段2，进行胶回收；②以等比例混合的回收的片段1和片段2为模板，F2和R1为引物，进行Over‑lapPCR，获得Klenow(exo‑)目的片段，进行胶回收；所述引物序列如下：F1：5’‑AAGCGCCGGTATTTGCATTTGCTACCGCAACCGACAGCCTTGATAACAT‑3’；SEQ ID NO：4；R1：5’‑CCCAAGCTTTTAGTGCGCCTGATCCCAGTTTTCG‑3’；HindIII；SEQ ID NO：5；F2：5’‑CATGCCATGGATCATCATCACCATCACCACATGATTTCTTATGACAACTACGTCACCA‑3’；NcoI；SEQ ID NO：6；R2：5’‑AAATGCAAATACCGGCGCTTTTTCCAG‑3’；SEQ ID NO：7；(2)构建重组表达质粒pTrc99a‑klenow(exo‑)分别对pTrc99a质粒和Klenow(exo‑)目的片段进行双酶切，以2：1的比例进行连接反应；连接产物转化大肠杆菌克隆菌株，获得阳性克隆，提质粒，获得重组表达质粒pTrc99a‑klenow(exo‑)；(3)重组表达质粒的诱导表达将重组表达质粒pTrc99a‑klenow(exo‑)转化大肠杆菌表达菌株，利用IPTG诱导，收集菌体，超声破碎，进行SDS‑PAGE，获得Klenow(exo‑)蛋白；(4)Klenow(exo‑)蛋白的初步纯化收集经IPTG诱导的菌体，用破碎缓冲液重悬菌体，进行均质破碎，收集液体，用镍柱做亲和层析，完成Klenow(exo‑)蛋白的初步纯化；(5)Klenow(exo‑)蛋白的进一步纯化通过预装柱HeparineHP，除去部分Klenow(exo‑)蛋白中残留的核酸，并完成Klenow(exo‑)蛋白的进一步纯化。