[发明专利]双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法及试剂盒

摘要

本发明公开一种双向热循环消减SELEX快速筛选方法及试剂盒，该方法将纳米（琼脂）磁珠材料、SELEX技术和高通量核酸测序有机结合，建立针对（复合）靶标分子的快速高效核酸适配体筛选技术体系及相应试剂盒。该试剂盒可快速筛选出特异性强、亲和力高的核酸适配体。该方法具有快速、高效、成本低、操作简单、可机械化完成等优点。

主权项

1.一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）靶磁珠制备：分别将捕捉磁珠与目标靶分子、消减靶分子混合，在37±0.3℃孵育30min分钟，洗涤缓冲液洗1次，形成磁珠‑目标靶、磁珠‑消减靶；再分别加入蛋白封闭液，37±0.3℃封闭1h小时后去上清，用洗涤缓冲液洗至无泡沫，分离磁珠中加入pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液，含0.1%的叠氮钠；（2）双向消减结合：将随机ssDNA库用结合缓冲液溶解，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却；正向结合：第一轮消减结合：将随机寡核苷酸文库先和磁珠‑消减靶复合物37℃结合1h，磁分离，吸出上清；将上清加入到磁珠‑目标靶复合物中，37℃结合1h，用0.5mL洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；在磁珠中加入结合缓冲液，95℃加热5min，重复3次，混合吸出的上清，上清为第一轮次级文库；从第二轮开始，将次级文库先与磁珠‑目标靶复合物结合，磁分离弃上清，用0.5mL洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；在结合目标靶的磁珠中，加入结合缓冲液，95℃加热5min，重复3次，混合吸出的上清，加入磁珠‑消减靶复合物中，37℃结合1h，磁分离，吸出上清为次级文库；反向结合：将磁珠‑消减靶复合物视为目标靶，磁珠‑目标靶复合物为消减靶进行结合，结合过程同正向结合；（3）洗涤：用洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；（4）洗脱：加入洗脱缓冲液洗结合有靶分子的磁珠3次后，磁分离，在磁珠中加入1×PCR Buffer，95℃加热 5分钟，磁分离，吸取上清，重复加热 3次，收集上清混匀；（5）次级文库的制备：实时荧光定量‑PCR对前轮筛选消减获得的ssDNA进行富集检测后，用不对称PCR方法和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶制备次级文库：以步骤（1）所述次级文库上清为模板DNA，PCR扩增16~20个循环后，得到第一轮筛选产物；再以筛选产物为模板，不对称PCR扩增20~30个循环，取PCR产物进行变性PAGE凝胶电泳，切取单链条带，粉碎，加入洗脱缓冲液 300μL，95℃加热5min，3000r/min离心收集上清，重复3次；将上清加入3000Dr 超滤管中，超滤20min，得到ssDNA次级文库；（6）循环筛选：重复步骤（1）‑（5），筛选7~15轮，每轮用实时定量‑PCR检测次级库对目标靶和消减靶的结合量，确定富集程度，制备适配体富集文库；（7）对适配体富集文库进行高通量测序。