[发明专利]一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法有效
| 申请号： | 201811152680.3 | 申请日： | 2018-09-29 |
| 公开（公告）号： | CN109321583B | 公开（公告）日： | 2023-08-15 |
| 发明（设计）人： | 林锋强;陈少莺;王劭 | 申请（专利权）人： | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/40 | 分类号： | C12N15/40;C12N15/85;C12N5/10 |
| 代理公司： | 福州智理专利代理有限公司 35208 | 代理人： | 康永辉 |
| 地址： | 350013 福建*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，通过从含有番鸭呼肠孤病毒细胞培养毒提取病毒基因组RNA，通过设计的特定引物，以病毒基因组RNA为模板RT‑PCR扩增MDRV全序列的基因分段，将目的基因分段进行酶切连接成MDRV10个基因片段，并与载体连接，挑取阳性菌落进行测序验证。将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞。在细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，获得MDRV重组病毒。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 构建 番鸭呼肠孤 病毒 反向 遗传 系统 方法 | ||
【主权项】：
1.一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，其特征在于包括下述步骤：（1）提取MDRV 基因组RNA；（2）以步骤（1）的RNA作为模板，用引物进行PCR扩增，得到相应的基因片段或分段的基因；（3）回收和纯化上述PCR产物，将相应分段基因进行酶切连接后，共获得10个基因片段；（4）将上述PCR获得的10个片段与pBD‑initial载体酶切连接加入到JM109感受态细胞中进行转化培养，培养24h提取菌落质粒为模板进行酶切和序列测定鉴定;（5） 将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞;37℃,5%CO2条件下，每天观察细胞病变情况;（6） 在AD293细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，在接毒后第4天出现细胞圆缩现象；6天出现细胞拉网，脱落现象；第7天时可以收毒;MDRV‑rMS‑A15(第15代传代毒)重组病毒毒价为10‑5TCID50/0.1mL;为了保持基因组RNA的完整性和纯度，步骤（1）可采用TRIzol试剂提取RNA;步骤（5）提取的质粒可采用质粒提取试剂盒进行提取;PCR引物需满足如下要求：1）S1‑S4片段各设计一对简并引物，上游引物在起始核苷酸的下游区域设计，下游引物在末端核苷酸的上游区域设计，设计的引物能够对MDRV S基因片段全序列进行阳性扩增；2）M1、M2、M3基因各分成2段进行扩增，分别设计两对引物;第一对上游引物在起始核苷酸的下游区域设计；第一对下游引物和第二对上游引物根据基因片段的一个酶切位点（M1为1542‑1547 EcoRI、M2为921‑926 EcoRV、M3为1067‑1072 Bsp1407I）附近区域进行设计；第二对下游引物在末端核苷酸的上游区域设计;通过PCR扩增后将片段进行特异性酶切连接即可得到MDRV M基因片段全序列;3）L1、L2、L3基因各分成3段进行扩增，分别设计三对引物; MDRV L1基因(3959bp)利用1424位NruI酶切位点和 2795为AclI 位点将L1基因分成三段进行扩增，L2基因(3830bp)利用1441位SacI酶切位点和 2719为HpaI 位点将L2基因分成三段进行扩增; L3基因(3907bp)利用1497位EcoRI酶切位点和 2799为NaeI 位点将L3基因分成三段进行扩增; 4）设计PCR引物时按pBD‑initial载体的要求，在上游引物5’端加上GCGCTAT七个碱基。
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- SFTSV膜蛋白真核双表达载体构建方法-202211244292.4
- 刘苗苗 - 济宁医学院
- 2022-10-12 - 2023-01-03 - C12N15/40
- 本发明公开了SFTSV膜蛋白真核双表达载体构建方法，具体包括以下步骤：步骤一、基因分析：发现SFTSV的膜蛋白上含有决定病毒与宿主细胞间相互作用的抗原决定簇；步骤二、密码子优化；步骤三、表达构建；步骤四、表达纯化：将真核表达载体转染到哺乳动物细胞中来表达目的蛋白，进行表达纯化测试，本发明涉及分子病毒学技术领域。该SFTSV膜蛋白真核双表达载体构建方法，通过将含有抗原决定簇的膜蛋白优化后亚克隆到真核表达载体PBudce4.1中，利用PBudce4.1的双表达载体特性，实现Gn蛋白和Gc蛋白的同时表达，构建出同时表达Gn蛋白和Gc蛋白的真核表达载体PBudCE‑Gn/Gc，大大提高了工作效率的同时，获得针对病毒膜蛋白的重组基因工程疫苗，为病毒防控提供思路。
- 一种分泌表达多抗原表位猪瘟病毒E2基因的重组病毒及制备方法与应用-201910185932.0
- 陈金顶;黄允真;章洋溢;聂恺阳;杨超;赵明秋 - 华南农业大学
- 2019-03-12 - 2022-09-13 - C12N15/40
- 本发明公开了一种分泌表达多抗原表位猪瘟病毒E2基因的重组病毒及制备方法与应用。本发明根据密码子的偏爱性，人工设计合成了含多个抗原表位的重组CSFV C株的免疫原性基因E2并构建了含有上述E2基因的重组杆状病毒，提高了E2基因在杆状病毒中表达水平和免疫原性。利用本发明的重组杆状病毒所表达rE2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受CSFV石门株的攻击；同时所述亚单位疫苗免疫动物后，还可用于鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物，具有较大的应用前景。
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