[发明专利]一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法

摘要

一种定量检测草鱼白介素‑10的双抗体夹心ELISA方法，包括如下步骤：S1、检测抗原标准品的制备与纯化；S2、捕获抗体的制备与纯化；S3、检测抗体的制备与纯化；S4、草鱼白介素‑10的双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立。本发明的有益效果是：1、本发明以鼠抗gcIL‑10抗体为捕获抗体，以兔抗gcIL‑10酶标抗体为检测抗体，以原核表达并纯化的rgcIL‑10为标准品，首次建立了一种定量检测gcIL‑10的双抗体夹心ELISA方法。2、本发明所建立方法的特异性强，以草鱼其他细胞因子以及小鼠IL‑10等为抗原进行双抗体夹心ELISA检测均无交叉反应，仅能检测到天然或重组表达的gcIL‑10。

主权项

1.一种定量检测草鱼白介素‑10的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、检测抗原标准品的制备与纯化；S2、捕获抗体的制备与纯化；S3、检测抗体的制备与纯化；S4、草鱼白介素‑10的双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立；S41、包被，用包被液将S2中制备的捕获抗体稀释至10μg/mL，按照100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜，弃去孔内包被液，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；S42、封闭，在经过S41处理后的96孔酶标板上，每孔加200μL封闭液，37℃封闭1.5h，弃去孔内封闭液，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；S43、加样，分别将待检样品、S1中制备的不同质量浓度的检测抗原标准品以及至少30份阴性样品，按照100μL/孔加入至经过S42处理后的96孔酶标板内，混匀，37℃孵育2h，弃去孔内液体，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；S44、加检测抗体，在经过S43处理后的96孔酶标板上，按100μL/孔加入S3中制备的检测抗体，所述检测抗体稀释至0.53μg/mL，37℃孵育1h，弃去孔内液体，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；S45、显色、终止与测定，在经过S44处理后的96孔酶标板上，按100μL/孔加入TMB底物液，37℃避光显色5min，每孔加50μL 2M硫酸终止反应后，使用酶标仪测定各孔反应液OD_450nm值，包括待检样品OD_450nm值、检测抗原标准品OD_450nm值以及阴性样品OD_450nm值，计算阴性样品OD_450nm的平均值及其标准差SD；S46、定性判定：若待检样品则为阴性结果，说明待检样品中不含草鱼白介素‑10；若待检样品则为阳性结果，待检样品中含有草鱼白介素‑10；若则为可疑结果，需重新检测；S47、定量检测，若经过S46定性判定后，待检样品中含有草鱼白介素‑10，通过以下方法检测草鱼白介素‑10的含量，以S43中检测抗原标准品质量浓度的对数为横坐标，以S45中对应的检测抗原标准品OD450nm值为纵坐标绘制标准曲线，将待检样品OD450nm值代入绘制的标准曲线中，获得待检样品中草鱼白介素‑10质量浓度的对数，进而得到待检样品中草鱼白介素‑10的含量。