[发明专利]产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法

摘要

本发明涉及一种产气荚膜梭菌α毒素双单抗夹心ELISA检测方法，该检测方法是采用原核表达的α毒素蛋白为免疫原，利用杂交瘤技术制备单克隆抗体作为检测抗体和捕获抗体，通过试验优化反应条件，以系列含量的α毒素蛋白作为标准制作标准曲线，建立了双单抗夹心ELISA方法，并对该方法各项指标进行验证。具体包括以下步骤：（1）α毒素原核表达；(2)抗α毒素单克隆抗体的制备；(3)双单抗夹心ELISA方法的建立；(4)标准曲线的建立；（5）对该双单抗夹心ELISA方法进行性能评价。该方法特异性好、灵敏度高、稳定性好，快速、简便，且能有效地定量检测A～E型产气荚膜梭菌培养上清中α毒素，为α毒素提供了高效的检测工具。

主权项

一种产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）产气荚膜梭菌α毒素的原核表达，得到纯化的重组α毒素蛋白；2）抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备：选择与骨髓瘤细胞Sp2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠作为免疫动物：首免为步骤1）中得到的纯化的重组α毒素蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后，100μg/只腹腔注射；二免、三免分别于首免后二周和五周将重组α毒素蛋白与等体积弗式不完全佐剂完全乳化后，100μg/只腹腔注射；三免后三周腹腔注射不加佐剂的重组α毒素蛋白50～100μg/只，注射后3‑5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合；取生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG1500进行化学法融合，运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆，得到抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞株CP f12；利用CP f12制备单克隆抗体F12；3）抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备：选取新西兰大白兔作为免疫动物，首免为纯化的重组α毒素蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射1mg/只；，首免后将弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组α毒素蛋白完全乳化每间隔两周免疫一次，三免后两周用不加佐剂的步骤1）得到的纯化的重组α毒素加强免，15d后采集兔血清，利用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,得到多克隆抗体；4）双抗体夹心ELISA定量检测方法及标准曲线的建立（1）用抗原包被液将多克隆抗体即包被抗体稀释至3μg/mL；100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；所述的抗原包被液组分为0.1M碳酸盐缓冲液，其pH9.6；（2）用PBST溶液洗涤3次，加入含5％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液200μL/孔，4℃封闭过夜；所述PBST溶液组分为：含0.05%Tween‑20的PBS溶液：NacL8g/L、KCL0.2g/L、Na₂HPO₄·12H₂O3.58g/L、KH₂PO₄0.27g/L，pH7.4；（3）用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品，100μL/孔，同时设置阴阳性和空白对照，阳性对照为步骤1)得到的纯化的重组α毒素蛋白，阴性对照分别为按常规方法制备的大肠杆菌培养上清和PBS缓冲液，所述PBS缓冲液组分为：含NacL8g/L、KCL0.2g/L、Na₂HPO₄.12H₂O3.58g/L、KH₂PO₄0.27g/L；空白对照为不加任何样品，37℃孵育1h；（4）3次PBST溶液洗涤后，将杂交瘤细胞株CP f12制备的单克隆抗体F12用PBS缓冲液稀释至0.2μg/mL，100μL/孔，37℃反应1h；（5）用PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液1:10000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育1h，PBST溶液洗涤3次；（6）最后加入可溶性TMB底物显色液100μL/孔,室温条件避光反应15min，用2M H₂SO₄溶液终止反应，450nm处读取吸光值；（7）以α毒素蛋白稀释浓度为横坐标，OD_450nm值为纵坐标绘制曲线图；根据曲线图，选择最佳线性范围，以浓度的自然对数LN(x)为横坐标，OD_450nm值为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中α毒素浓度；5）结果判定标准的确定计算阴性样品平均值与标准差（SD)，求得为阳性临界值，为阴性临界值；运用建立的DAS‑ELISA测定为阳性，为阴性，$\stackrel{\‾}{X}+2\mathrm{SD}\<{\mathrm{OD}}_{450\mathrm{nm}}\<\stackrel{\‾}{X}+3\mathrm{SD}$为可疑样品。