[发明专利]一种提高马尾松体胚诱导率的方法

摘要

本发明提供一种提高马尾松体胚诱导率的方法，包括外植体预处理、外植体消毒和体胚诱导工序，采集健康、无病虫害、合子胚处于裂生多胚期的马尾松优树未成熟球果作为外植体，对外植体进行预处理和消毒处理后，无菌剥取外植体球果中的雌配子体，将其平放于诱导培养基中并置于适宜的环境中培养，胚性愈伤诱导培养周期为：3‑4周，最后获得生长迅速、活力旺盛的马尾松胚性细胞系。本发明经过系列优化的外植体处理与消毒，再剥取球果中的雌配子体进行诱导，形成了大量活力旺盛的胚性细胞系，为进一步开展马尾松体胚育苗、种质创新与生物工程育种奠定了有力的物质资源与技术保障，具有较好经济效益、社会效益和生态效益。

主权项

1.一种提高马尾松体胚诱导率的方法，其特征在于：包括外植体预处理、外植体消毒和体胚诱导工序，采集健康、无病虫害、合子胚处于裂生多胚期的马尾松优树未成熟球果作为外植体，对外植体进行预处理和消毒处理后，无菌剥取外植体球果中的雌配子体，将其平放于诱导培养基中并置于适宜的环境中培养，胚性愈伤诱导培养周期为：3‑4周，最后获得生长迅速、活力旺盛的马尾松胚性细胞系；主要操作步骤如下：（1）外植体预处理：采集健康、无病虫害、合子胚处于裂生多胚期的马尾松优树未成熟球果作为外植体，用体积浓度45%酒精+体积浓度0.03%链霉素+100 mg·L‑1烟酸混合液进行外植体表面擦拭消毒后，将外植体装置塑料自封袋中，并置于5‑8℃冰箱中存放10‑14 d；（2）外植体消毒：将预处理后的外植体取出经流水冲洗2 h后，置于体积浓度为0.1‑0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡1‑2 h，取出外植体将其置于体积浓度为60 %酒精中浸泡3‑5 min，再移入体积浓度为8‑10 %的次氯酸钠溶液中浸泡2‑3 min，取出放于体积浓度为8 %双氧水+体积浓度0.2%吐温20+300 mg·L‑1抗坏血酸的混合液中搅拌浸泡30‑40 min后，最后用无菌水冲洗4次，每次冲洗3‑5 min；（3）体胚诱导：在超净工作台上，无菌剥取经步骤（2）处理后外植体球果中的雌配子体，将其平放于诱导培养基中并置于适宜的环境中培养，胚性愈伤诱导培养周期为：3‑4周，获得生长迅速、活力旺盛的马尾松胚性细胞系；所述的诱导培养基为：改良DCR培养基 + 2,4‑D 0.5 mg·L‑1 + NAA 5.0‑9.0 mg·L‑1 + 油菜素类酯 1.0‑2.0 mg·L‑1+ ABA 0.5‑1.0 mg·L‑1 + 多效唑 0.66 mg·L‑1+ 硝酸银 0.5‑1.0 mg·L‑1 +谷氨酰胺 2000 mg·L‑1 + 酸水解酪蛋白1000 mg·L‑1 + 葡萄糖20000 mg·L‑1 + 果糖10000 mg·L‑1 + 乳糖10000 mg·L‑1 + 琼脂4500 mg·L‑1 + 活性炭 3000‑5000mg·L‑1 + 250 mg·L‑1 MES。