[发明专利]三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法

摘要

三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法，属于生物传感器制备领域。包括步骤：1)确定待检测miRNA，并遵循序列互补原则设计发卡探针；2)在玻碳电极表面电沉积氧化石墨烯；3)1‑芘丁酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(PASE)与亚甲基蓝(MB)同时竞争吸附在电还原氧化石墨烯表面；4)3‑叠氮基‑1‑正丙胺(3‑Azido‑1‑PrA)与PASE发生酰胺反应，将电极表面叠氮化；5)合成Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS标记的电化学发光探针Ru‑DNA；6)Ru‑DNA发生点击化学反应组装到电极表面。7)当目标miRNA存在时，阻碍发光物质Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS与淬灭剂MB之间共振能量转移的发生，引起电化学发光信号强度改变。本发明可实现对目标miRNA的灵敏、快速、简便检测。

主权项

1.三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)确定待检测的目标miRNA，设计与其碱基互补的DNA发卡探针序列；2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干后将电极浸入1mg/mL氧化石墨烯溶液中，通过循环伏安法，初始电压和高电位设置为0.5V，低电位为‑1.5V，在此区间内循环扫描电沉积氧化石墨烯，扫描圈数为10圈，电沉积全程在氮气氛围中；3)用移液枪吸取10μL 1‑芘丁酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯PASE与亚甲基蓝MB的混合液，滴加在电极上，室温下放置1h，二者通过π‑π堆积作用吸附在电还原氧化石墨烯表面；其中PASE和MB的总摩尔浓度为5mM且摩尔浓度比为1:3；4)滴加10μL 3‑叠氮基‑1‑正丙胺3‑Azido‑1‑PrA溶液在电极表面，室温下反应；5)电化学发光发卡探针Ru‑DNA的合成：将50μL 50μM DNA发卡探针溶液加入200μL 1mM Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的DMF溶液中，此反应于恒温混匀仪中室温下振荡过夜；然后向混合液中加入100μL 3mol/L无水醋酸钠溶液以及1.5mL无水乙醇，将溶液在‑20℃下冷却24h；将冷却后的溶液在12000转/分钟转速下离心30min，小心去除上层黄色溶液，沉淀物用无水乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS；最后将得到的黄色沉淀溶于50μL 5mM PBS缓冲液中，于‑20℃储存；6)在电极表面滴加10μL含有电化学发光发卡探针的点击化学溶液，于室温下反应过夜；此过程中发光探针的5’端炔烃基团部分与电极表面的叠氮基团在五水硫酸铜、抗坏血酸钠和三[(1‑苄基‑1H‑1,2,3‑3唑‑4‑基)甲基]胺(TBTA)的催化作用下发生点击化学反应，将发光探针Ru‑DNA组装到电极表面；点击化学溶液中含有1μM五水硫酸铜、2μM抗坏血酸钠、1.1μM三[(1‑苄基‑1H‑1,2,3‑3唑‑4‑基)甲基]胺以及20μM Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记的DNA发卡探针；7)将目标miRNA溶液滴加到组装好的电极表面，于室温下孵育30min，Ru‑DNA发卡结构打开并转换成刚性的DNA‑miRNA双链结构。