[发明专利]新疆多浪羊不同生理时期繁殖相关蛋白的筛选与鉴定方法

摘要

本发明公开了一种新疆多浪羊不同生理时期繁殖相关蛋白的筛选与鉴定方法，属于生物技术领域，该方法包括以下步骤：步骤1、新疆多浪羊不同生理时期卵巢的获得：步骤2、蛋白提取；步骤3、Bradford蛋白定量和标准曲线的绘制；步骤4、样品标记和等量混合；步骤5、高PH条件下C18色谱柱的HPLC分级；步骤6、质谱分析步骤7、数据处理。本发明通过iTRAQ试剂标记，被标记的肽段进行高效液相色谱HPLC分离及质谱检测MS，共鉴定出4847个蛋白，其中表达显著差异的蛋白470个。

主权项

1.一种新疆多浪羊不同生理时期繁殖相关蛋白的筛选与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1、新疆多浪羊不同生理时期卵巢的获得：/n通过同期发情、发情鉴定和妊娠鉴定技术，将发情间期、发情期和妊娠期多浪羊屠宰后立即取出卵巢，并用PBS缓冲液冲洗PH7.4组织表面，之后迅速投入液氮进行快速冷冻，并带回实验室-80℃保存备用；/n步骤2、蛋白提取：/n分别取发情间期、发情期和妊娠期多浪羊卵巢0.1g，加入0.4mL的蛋白裂解液，所述蛋白裂解液的成分为：8.0M脲、50mM NH4HCO3、1×蛋白酶抑制剂，进行超声破碎，其设置为每次2s，间隔10s，共5min，整个操作在冰上进行；超声破碎物在冰上放置20min后，4℃，10,000×g，离心30min，取上清转入新管，然后将蛋白提取液分装并在-80℃冰箱保存备用；/n步骤3、Bradford蛋白定量和标准曲线的绘制/n采用Bradford法对蛋白进行定量，先将已知含量的牛血清白蛋白BSA配成不同浓度的蛋白溶液，分别测定其显色后的光吸收值OD值，根据OD值与蛋白浓度之间的线性关系，绘制出蛋白浓度的标准曲线，然后测定待测蛋白溶液显色后的OD值，参照BSA标准曲线计算待测蛋白的浓度；所有操作步骤均在室温状态完成；/n分别取BSA 8μg、10μg、12μg、14μg、16μg、18μg配成不同浓度的蛋白溶液，并测定吸光值，如果相关性R²<0.95，标准曲线不能用于计算，重新进行实验；/n根据计算配置蛋白溶液，总体积为20μL；同时准备被检样本1.0μL，与19μL水混合，加入检测酶标板，每个样本检测2个复孔；每个复孔加入200μL Bradford工作液，轻微吸打混匀；避光，室温静止放置15min；用酶标仪检测，检测波长设定在595nm；根据标准曲线推导出检测蛋白的总量，并计算相应浓度；步骤4、样品标记和等量混合/n各组样品肽段分别取100μg，按照AB公司试剂盒：iTRAQ Reagent-8plex MuLtiplexKit说明书进行标记，标记之后取少量样本混合，进行LC-MS/MS质谱检测，查看iTRAQ标记效率；/n步骤5、高PH条件下C18色谱柱的HPLC分级/n步骤6、质谱分析/n毛细管高效液相色谱/n每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC 1000进行分离；缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈溶液；色谱柱以95％的A液平衡；样品由自动进样器上样到色谱柱C18 trap column，C18 3μm 100μm×2cm，再经分析柱C18 column，C18 3μm75μm×15cm分离，流速为300nl/min；/n质谱鉴定/n每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Orbitrap Fusion lumos质谱仪进行质谱分析；/n步骤7、数据处理/n原始质谱数据/n质谱分析原始数据为RAW文件，用软件用软件Sequest和Proteome Discoverer进行搜库定性及定量分析；/n数据库/n本次使用数据库：protein.selected.fasta/n搜库/n搜库时将RAW文件通过Proteome Discoverer提交至Sequest服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。/n