[发明专利]一种用于检测EML4-ALK、ROS1和RET融合基因突变的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种通过文库构建并测序一次性检测EML4‑ALK，ROS1和RET融合基因突变的方法。本发明能在3小时内,由1‑2000个新鲜组织细胞，10pg‑20ng经提取的总RNA，或血浆游离RNA为起始，在ALK,ROS1,RET特异性引物与逆转录酶的作用下对其中包含融合型信息的mRNA进行逆转录并获得cDNA第一链，而后以模板转换技术在cDNA的3’端添加一段接头序列(带有分子标签)并进行cDNA二链生成，而后以接头区段为引物锚定位点进行指数扩增的同时在cDNA两端加上Illumina文库接头，以获得符合下游分析要求的高质量cDNA文库。

主权项

1.一种通过文库构建及二代测序检测EML4-ALK,ROS1,RET融合基因突变的方法，包括：1)获得总RNA2)使用基因特异性逆转录引物与总RNA的ALK、ROS1、RET的mRNA融合点下游最近的外显子上特异性区段进行互补配对，在逆转录酶的作用下对所述mRNA进行逆转录获得cDNA第一链；其中所述基因特异性逆转录引物为(5’到3’)：X...X+MM+TCTAGCCTTCTCG，X...X表示与ALK、ROS1、RET的mRNA互补配对的特异性结合序列，M为A或C；3)在获得的cDNA第一链的3’端不依赖模板添加2-5个C核苷酸；4)使用步骤3)获得的cDNA为模板，使用模板转换寡核苷酸在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性下进行cDNA二链生成；所述模板转换寡核苷酸为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTKK+1-4个核糖鸟苷+一个LNA鸟苷，并在5’端以AMO修饰；5)在第二链生成后，利用有限的循环以通用引物和Index引物进行扩增获得cDNA，其中所述通用引物为：5’NH2-C6-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM(SEQID No.1)所述Index引物为：5’NH2-C6-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTKK，其中NNNNNN为Index，N为任意碱基(SEQ ID No.2)；6)测序后针对该文库结构和ALK、ROS1、RET基因各自的特异性逆转录引物和各自的识别区进行搜索，即可找出融合信息。