[发明专利]一种用于检测EML4-ALK、ROS1和RET融合基因突变的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种通过文库构建并测序一次性检测EML4‑ALK，ROS1和RET融合基因突变的方法。本发明能在3小时内,由1‑2000个新鲜组织细胞，10pg‑20ng经提取的总RNA，或血浆游离RNA为起始，在ALK,ROS1,RET特异性引物与逆转录酶的作用下对其中包含融合型信息的mRNA进行逆转录并获得cDNA第一链，而后以模板转换技术在cDNA的3’端添加一段接头序列(带有分子标签)并进行cDNA二链生成，而后以接头区段为引物锚定位点进行指数扩增的同时在cDNA两端加上Illumina文库接头，以获得符合下游分析要求的高质量cDNA文库。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种用于一次性检测EML4-ALK、ROS1和RET融合基因突变的方法，所述方法包括构建文库并测序。

背景技术

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各癌症之首。每年全世界有超过130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。据2010年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万，肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤(Orras JM,Fernandez E,Gonzalez JR,et al.Lung cancer mortality in European regions(1955-1997).Ann Oncol,2003,14(1):159_161；中华人民共和国卫生部，《2010年中国卫生统计》年鉴)。

肺癌从组织病理学上可以分为小细胞癌(SCLC)和非小细胞癌(non-small celllung cancer,NSCLC)两大类，其中非小细胞癌约占肺癌总病例的85％。在我国肺癌患者5年的生存率仅为13％，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相匹配科学的治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。

目前化疗仍是肺癌主要治疗手段，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。

EML4-ALK(Echinodem Microtubule-associated protein-Like 4-AnaplasticLymphoma Kinase)基因融合突变的发现为NSCLC患者提供了新的治疗靶点。EML4(棘皮动物微管相关蛋白4)与微管形成密切相关；ALK(间变性淋巴瘤激酶)在肿瘤细胞信号转导起着重要的调节作用。EML4主要包含卷曲螺旋结构、疏水EMAP蛋白结构域、色氨酸-天冬氨酸重复结构；EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和P23带，相隔约12Mb。这两个基因片段的倒位融合，即inv(2)(p21p23)能够使得组织表达新的EML4-ALK融合蛋白。融合后的EML4启动子位于ALK酪氨酸激酶的上游，从而使融合基因活化，表达EML4-ALK融合蛋白。通过EML4胞外结构形成的二聚体使ALK受体持续磷酸化，进而激活持续下游的细胞信号通路(Soda M,et al.Nature2007；448:561～6；Martelli MP,et al.Am.J.Pathol.174(2):661_70；Koh Y,et al.J Thorac Oncol 2011；6:905-912.)。

新融合基因R0S1的发现为肺癌患者提供了新的治疗靶点。R0S1是胰岛素受体家族的一种受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase),R0S 1融合首先发现于恶性胶质瘤中，其融合突变发生于6号染色体q22区(Birchmeier et al.Proc Natl Acad Sci.87(12):1990；Charest et al.Genes Chromosomes Cancer.37:58,2003)。R0S1融合包含一个完整的酪氨酸激酶区域，其融合突变会导致细胞下游信号通路的激活，从而影响细胞的生长，增殖和分化。最新的研究表明ROS1是一种新的肿瘤驱动突变基因，其融合在非小细胞肺癌中被定为一种新的分子亚型。