[发明专利]一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法

摘要

本发明提供了一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，该技术方案一方面利用I群4型腺病毒灭活疫苗制备卵黄抗体，另一方面构建了I群4型腺病毒hexon蛋白抗原表达载体，并利用原核表达系统制备抗原蛋白；在此基础上，本发明考察了抗原抗体效价配比对抗原抗体混合液免疫保护效果的影响，基于此确定了最优的复配方式，并设计了冻干剂型。本发明在原有腺病毒卵黄抗体的基础上，加入腺病毒hexon蛋白抗原，制成复合物。这种腺病毒抗原抗体复合物可以抵抗病原微生物引起的持续性感染，避免抗生素的过量使用，由于使用的抗原不是完整的病毒抗原，而是腺病毒的hexon蛋白制成的抗原，可以减少全毒向外散毒的危险，更加安全有效。

主权项

一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)用I群4型腺病毒灭活疫苗免疫产蛋母鸡，免疫三次，免疫间隔3周；三免后2周取AGP效价≥1:64的高免蛋提取卵黄抗体；2)利用序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的引物，以及腺病毒基因组DNA为模板执行PCR扩增，将扩增产物链接至pMD‑18T载体，得到重组载体pMD‑18T‑FAV，用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对重组载体pMD‑18T‑FAV和表达载体pET‑30a进行双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pET‑30a，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET‑30a‑FAV；3)将pET‑30a‑FAV质粒转化到E.coli BL21(DE3)，用原核表达系统表达包涵体蛋白，用Ni螯合树脂柱对蛋白及进行纯化后对包涵体蛋白及进行复性，获得I群4型腺病毒hexon抗原；4)取步骤1)所得的卵黄抗体，配制抗体琼扩效价为1:16的溶液；取步骤3)所得的I群4型腺病毒hexon抗原，配制抗原琼扩效价为1:16的溶液；将二者等体积混合，得到抗原抗体混合液；5)取步骤4)所得的抗原抗体混合液，向其中加入2％海藻糖和1％甘露醇冻干保护剂，冻干得到产物。